王永亮 李 帥 高志華 張 勤

(河南出入境檢驗(yàn)檢疫局， 450003)

登革熱是一種以急性發(fā)熱為主要癥狀的蚊媒傳染病，由登革病毒引起，該病毒為黃病毒屬，單鏈RNA病毒。登革病毒(Dengue virus,DV)由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型血清型構(gòu)成(Srikiatkhachornetal.，2011)，傳播媒介為白紋伊蚊Aedesalbopictus和埃及伊蚊Aedesaegypti，傳播方式為“人—蚊—人”，人群普遍易感。該病廣泛流行于東南亞、中南美洲和非洲100多個(gè)國(guó)家及地區(qū),是導(dǎo)致疫源地國(guó)家疾病負(fù)擔(dān)最為嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題(Bhattetal.，2013)，引起了國(guó)際社會(huì)高度關(guān)注。河南境內(nèi)存在白紋伊蚊，該省口岸入境國(guó)際航班中，90﹪來自東南亞登革熱流行疫區(qū)，因此存在登革熱傳入風(fēng)險(xiǎn)。為實(shí)施口岸輸入性疫情的精準(zhǔn)防控，對(duì)2例入境發(fā)熱歸國(guó)人員的血清樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室實(shí)時(shí)熒光RT-PCR鑒定，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 病例溯源

病例1：賈某，男，29歲，河南省許昌市人， 2017年1月22日經(jīng)由香港過境，最后在河南口岸入境，因發(fā)熱接受檢驗(yàn)檢疫醫(yī)學(xué)巡診，體溫檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，腋下溫度39.2℃。詢問和審核護(hù)照確認(rèn)旅行史：染疫嫌疑賈某出境前健康檢查未見異常，于2017年1月10日赴斯里蘭卡做12日短期旅游。自述旅游期間無(wú)任何不適反應(yīng)，承認(rèn)有在觀光旅游中被“花腿”蚊蟲多次叮咬的事實(shí)。賈某于1月22日自斯里蘭卡出境，經(jīng)由香港轉(zhuǎn)機(jī)在河南口岸入境，現(xiàn)場(chǎng)采取染疫嫌疑人血清樣本，并于1月23日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定。

病例2：史某，男，26歲，河南省商丘市人，為某旅行社領(lǐng)隊(duì)，出境前無(wú)任何身體不適，于2017年12月8日帶領(lǐng)旅行團(tuán)赴泰國(guó)做6日短期旅游。于2017年12月13日結(jié)束旅游由泰國(guó)出境，在河南口岸入境。其本人有旅游經(jīng)驗(yàn)知識(shí)，因自身發(fā)熱、咽喉腫痛等不適感，主動(dòng)向機(jī)場(chǎng)口岸檢驗(yàn)檢疫人員申報(bào)病史，自述景區(qū)旅游過程中多次被“花蚊子”叮咬。經(jīng)醫(yī)學(xué)巡診，查體：腋溫39.5℃，雙側(cè)扁桃體1度腫大，現(xiàn)場(chǎng)采取血清樣本， 12月15日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定。

對(duì)上述兩例患者均進(jìn)行后續(xù)醫(yī)療管理，追蹤直至其疾病康復(fù)，無(wú)傳染性為止。

1.2 鑒定方法

1.2.1主要試劑和儀器：病毒RNA/DNA提取試劑盒(天隆科技)，登革病毒Ⅱ型核酸檢測(cè)試劑盒(上海之江生物)，Agilent Technologies Stratagene Mx3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2.2核酸提?。喊凑詹《綬NA/DNA提取試劑盒(天隆科技)中的說明書提取血清病毒RNA,-20℃冰箱保存。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光RT-PCR： RT-PCR反應(yīng)體系25 μL：包括登革熱病毒Ⅱ型核酸檢測(cè)試劑盒內(nèi)的18 μL混合液、1 μL RT-PCR酶、1 μL內(nèi)部對(duì)照品(對(duì)每個(gè)待測(cè)樣本的基因擴(kuò)增進(jìn)行監(jiān)控)，5 μL待測(cè)樣本RNA；同時(shí)使用登革熱病毒Ⅱ型核酸檢測(cè)試劑盒內(nèi)自帶的陰對(duì)照品(監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)是否有污染)、陽(yáng)性對(duì)照品(監(jiān)測(cè)試劑盒是否有效)各5 μL。反應(yīng)程序如下：45℃×10 min；95℃×15 min；循環(huán)1次，95℃× 15 s，60℃× 60 s，循環(huán)40次。單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃。在陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照品成立的條件下，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

根據(jù)登革病毒Ⅱ型核酸測(cè)定試劑盒說明書實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定陽(yáng)性對(duì)照Ct≤35時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線圖可知1號(hào)陽(yáng)性對(duì)照Ct值為17，2號(hào)陽(yáng)性對(duì)照Ct值為15(證明檢測(cè)試劑盒有效)；1號(hào)病例血清樣本有典型的擴(kuò)增曲線Ct值為19；2號(hào)病例血清樣本有典型的擴(kuò)增曲線Ct值為19(圖1)，均判定為陽(yáng)性。

圖1 RT-PCR熒光定量檢測(cè)Fig.1 RT-PCR fluorescence quantitative chart of cases1：1號(hào)陽(yáng)性對(duì)照；2：2號(hào)病例核酸；3：2號(hào)陽(yáng)性對(duì)照； 4： 1號(hào)病例核酸。1: Positive control of case 1; 2: DNA of case 2; 3: Positive control of case 2; 4: DNA of case 1.

3 討論

登革熱及其媒介伊蚊主要遍布于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，氣候變暖、全球化、國(guó)際旅行、人居環(huán)境改變和病毒變異等，是導(dǎo)致全球登革熱疫情不斷擴(kuò)張的主要因素(Lederetal., 2013)?，F(xiàn)在，登革熱已經(jīng)流行于全球六大世界衛(wèi)生組織區(qū)域，125個(gè)國(guó)家成為登革熱地方性流行疫區(qū)(Bradyetal., 2014)。迄今為止，全球每年登革熱的發(fā)病率估計(jì)波動(dòng)在0.5～2.0億之間，制圖法評(píng)估發(fā)病率則接近4.0億(Bradyetal., 2012)。

河南是內(nèi)陸口岸，本地歷史上沒有登革熱流行記載。2005年9月份，郝宗宇等(2006)報(bào)道，一起在新加坡留學(xué)的女性大學(xué)生歸國(guó)后因發(fā)熱被檢出感染登革熱。此后至2013年9月份，河南禹州發(fā)生首起輸入性登革熱暴發(fā)流行(王全新，2015)，確診病例73人，杜燕華等(2015)進(jìn)行病理溯源鑒定顯示為：登革熱病毒Ⅰ型WW2014病毒株，屬于第Ⅴ基因亞型，與印度2008—2011年分離的病毒株親緣關(guān)系最近，核酸同源性在98.2%～99.4%之間，未發(fā)生重組，推測(cè)可能此前已有印度登革熱Ⅰ型毒株輸入廣東佛山，又輸入河南境內(nèi)。本次2例登革熱患者均來自東南亞地區(qū)的斯里蘭卡和泰國(guó)，進(jìn)行短期旅游后歸國(guó)，分別于2017年元月和12月份入境，實(shí)驗(yàn)室鑒定2例染疫者感染病毒均為Ⅱ型登革病毒，鑒于河南省從未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型登革病毒，結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查，確認(rèn)均為輸入性登革熱病例，染疫地分別推測(cè)為斯里蘭卡和泰國(guó)。

河南地處溫帶，存在登革熱傳播的重要蚊媒——白紋伊蚊(孫正，1982)，夏秋兩季是白紋伊蚊活動(dòng)的高峰期，加之河南口岸是出入境人員貨物的重要內(nèi)陸口岸，因此存在著輸入性登革熱傳入的極大風(fēng)險(xiǎn)(Guzmanetal., 2010)。由此提示，檢驗(yàn)檢疫部門應(yīng)加強(qiáng)輸入性傳染病疫情的預(yù)警監(jiān)測(cè)(張亮等，2017)，對(duì)輸入性傳染病實(shí)施精準(zhǔn)防控。