林棟 朱慧鋒 張勤忠 吳世良 李良文（余杭區(qū)第二人民醫(yī)院 浙江 杭州 311121）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性關(guān)節(jié)病，表現(xiàn)為骨質(zhì)增生，軟骨破壞、變性等[1]。隨著我國人口老齡化，OA發(fā)病率呈逐步上升。miRNA是一類短的內(nèi)源性非編碼RNA，通過抑制mRNA的翻譯來調(diào)控機體蛋白表達[2]。miRNA參與多種炎性和自身免疫性疾病的發(fā)病過程，且可能參與OA的發(fā)展過程[3,4]。近年來，越來越多的miRNAs被證明在骨科疾病中起著重要作用[5]。而有實驗證明，miRNA-214在骨質(zhì)疏松的骨重塑過程中對破骨細胞的功能有調(diào)控作用[6]。為進一步研究miR-214的功能，本實驗旨在探討其在不同OA分期的表達情況，為治療骨關(guān)節(jié)炎尋找靶向標記物提供依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月—2018年8月在我院因膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎住院并行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療患者45例組成OA組，選擇同期在我院因創(chuàng)傷行下肢含膝關(guān)節(jié)截肢術(shù)患者10例組成對照組，其中OA組患者術(shù)前均行雙膝關(guān)節(jié)負重位X線檢查，并依據(jù)Kellgren-LawrenceX線診斷標準將其分為Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組、Ⅳ級組。兩組患者的一般資料見表1，入選的患者均對本研究知情同意，且獲得醫(yī)院倫理委員會同意。

表1 兩組患者一般資料對比

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 取收集的脛骨平臺軟骨下骨，用陶瓷研缽將其在液氮下快速研磨成粉狀，并取100 mg裝入1.5ml EP管中，用TRizol 法提取RNA（每個EP管中加入1mlTRizol，振蕩搖勻，室溫下靜置15min，然后加入0.2ml氯仿，振蕩搖勻15s，再室溫靜置15min，4℃、12000rpm離心15min，取其上層水相0.5ml置于另一EP管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，靜置15min使RNA沉淀，4℃、12000rpm離心10min后，棄上清，加入1ml75%酒精，4℃、7500rpm離心5min，再棄上清，晾干15min，加入DEPC水溶解，振蕩搖勻），樣本經(jīng)上述裂解、分層、RNA 沉淀、洗滌和溶解后，測定 RNA 濃度和純度，確保后續(xù)試驗準確度。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 根據(jù)qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（SYBR Green ReverTra Ace qPCR RT Kit）操作方法在37℃下配置20ul反應(yīng)體系，將測定濃度后的RNA 樣本加入反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將稀釋后的5ulRNA樣本和3ul的目的基因引物及內(nèi)參U6加入預(yù)先按照說明書中提供的試劑配成每份7ul的混合液中，離心后放進PCR儀反應(yīng)，條件設(shè)定為16℃30min、42℃ 30min 及 85℃ 5min。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測miR-214 按照說明書以及引物的Tm值制定PCR循環(huán)條件，并在Real-time PCR儀上擴增。擴增條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5S，55℃退火10s，72℃延長15s，進行40個循環(huán)，其結(jié)果以反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到閾值時所需循環(huán)數(shù)Ct表示，采用2-△△Ct法進行統(tǒng)計，比較OA組與對照組成骨細胞內(nèi)相關(guān)的基因的表達水平。

圖1 兩組患者成骨細胞中miR-214的表達情況（P＜0.05）

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

運用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，各組間作比較采用ANOVA方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

通過分析miR-214在正常膝關(guān)節(jié)及OA患者成骨細胞中的表達水平（見圖1），可見OA組miR-214的表達水平明顯高于對照組，OA組樣本中，Ⅲ級組中miR-214的表達水平明顯高于其他3組，各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3.討論

膝關(guān)節(jié)OA以關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨進行性改變，骨質(zhì)增生和滑膜組織炎癥反應(yīng)為主要特征，不同程度影響患者生活質(zhì)量，現(xiàn)今OA后期治療金標準是人工關(guān)節(jié)置換術(shù)[7]。膝關(guān)節(jié)OA復(fù)雜的發(fā)病機制尚未完全闡明，已得到越來越多學(xué)者的關(guān)注。而對骨關(guān)節(jié)炎治療方法的探索，也成為分子生物領(lǐng)域的重點[8]。

近年來，有研究顯示微小RNA（microRNA）在中老年退行性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[9]。Iliopoulos等將OA病人和健康人分為兩組，檢測軟骨組織中的365種miRNA表達情況，最終篩查出16種miRNA表達情況存在差異，其中9種miRNA（miR-22、483、377、16、103、30b、223、509、23b）表達上調(diào)，其余的7 種（miR-29a、337、140、25、26a、210、373）則表達下降?；诂F(xiàn)今對于miRNAs在骨和軟骨中的研究，miRNAs 被認為在調(diào)節(jié)OA中基因表達中是最具前沿、高效能的方法[10]。

有學(xué)者報道，miRNAs在骨與軟骨組織的最新研究中，miR-214被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)控成骨轉(zhuǎn)化作用，可調(diào)控小鼠成肌細胞功能，如成骨分化功能可被抑制；同時miR-214可通過靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄激活因子，抑制成骨細胞活性，抑制其基質(zhì)礦化過程，從而促進骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展[11]。然而遺憾的是未能證實miR-214在OA發(fā)展機制中的功能。

通過本實驗，我們證實了miR-214在OA成骨細胞中的異常表達，并且發(fā)現(xiàn)，OA病人成骨細胞中miR-214明顯高于正常人群，Ⅲ級組中miR-214表達最高，并且明顯高于IV級，筆者認為整個OA病程可以概括為骨質(zhì)吸收→骨質(zhì)增生→骨質(zhì)硬化→骨贅，然而都存在骨重塑。而本實驗關(guān)于miR-214的表達數(shù)據(jù)可以表明miR-214可能在故重塑中起重要作用。而之所以Ⅲ級組中miR-214數(shù)據(jù)高于IV級組，可以表明骨質(zhì)吸收的波動，帶來miR-214的表達波動，隨著增高而表達增多，但是晚期骨質(zhì)增生→骨贅形成，miR-214表達又有所下降，由此判斷，miR-214可能通過調(diào)控成骨與破骨細胞活性最終實現(xiàn)調(diào)節(jié)骨重塑過程。

綜上所述，本實驗認為miR-214在OA的發(fā)展中有重要作用，可能通過調(diào)控某重要基因的表達，參與關(guān)節(jié)軟骨退化及骨重塑。為下一步對miR-214及其他相關(guān)miRNAs在OA中的調(diào)控機制的研究提供理論基礎(chǔ)。