郝良玉，曲 晗，李志萍，王習(xí)文，王宇田，孫 瑞，崔煜菲 綜述，夏志平，△，李乾學(xué)▲ 審校

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.軍事獸醫(yī)研究所，吉林長春 130062)

隨著當(dāng)今社會經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，傳統(tǒng)的病原微生物檢測方法已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代的需求。傳統(tǒng)的菌落培養(yǎng)和血清學(xué)檢測方法不僅費(fèi)時、費(fèi)力，而且只能局限在實(shí)驗(yàn)室中操作，而基于抗原抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)，因其容易出現(xiàn)假陽性檢測結(jié)果，盡管方法簡便但并不適用于精準(zhǔn)分析。目前實(shí)驗(yàn)室常見的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR法)，因其具有檢測范圍廣、明暗度較高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)受到歡迎，但實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備沉重，并不適用于現(xiàn)場快速檢測。因此，需要探尋一種新型技術(shù)，以達(dá)到適應(yīng)現(xiàn)場、精準(zhǔn)檢測、快速研判的目的。

1 芯片實(shí)驗(yàn)室研究進(jìn)展

微流控技術(shù)是一種交叉學(xué)科技術(shù)，在微尺度管道(5～500 μm)內(nèi)操控微小體系流體(10-9～10-18L)的新型科學(xué)研究平臺，經(jīng)過數(shù)余年的發(fā)展，現(xiàn)已成為生化分析中的一個獨(dú)立領(lǐng)域。在微流控平臺上，可以針對液體或氣體、流體進(jìn)行微升、納升甚至皮升級的生物化學(xué)反應(yīng)，能極大降低試劑的消耗量(至少2～3 個數(shù)量級)[1]。微流控芯片，簡單來講就是指待檢測樣品在一個小的實(shí)驗(yàn)室裝置中連續(xù)完成樣品核酸的提取、純化、PCR、跑膠等過程而不需要人為的外在干預(yù)。微流控芯片作為當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)可以集中地將實(shí)驗(yàn)室功能轉(zhuǎn)移到芯片上，把原有大型檢驗(yàn)儀器微型化制成可完成生化等分析的便攜式儀器。

微流控芯片技術(shù)是在芯片毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，通過微加工手段在金屬、硅、玻璃、高分子聚合物等材質(zhì)的基片上，加工出微米級別的流體通道、檢測室等微結(jié)構(gòu)單元，從20世紀(jì)90年代起，微流控技術(shù)被多數(shù)人定義為一種分析化學(xué)平臺進(jìn)而逐步快速發(fā)展。我國微流控研究起步較晚，但經(jīng)過十多年的發(fā)展，微流控技術(shù)也已走向成熟。2000年以后，隨著微流控芯片的深入研究，這種技術(shù)逐漸得到學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界更高層次和更大范圍的認(rèn)可。同時，這項(xiàng)技術(shù)作為微量流體亞毫米級別尺寸上的一種精確操控技術(shù)，將生物學(xué)與化學(xué)上所需的基本操作單位結(jié)合在小型芯片上。這種芯片多由儲液池和微通道構(gòu)成，微通道包括有入口、主通道、輔助通道(側(cè)流通道)和出口。根據(jù)不同需要設(shè)計的入口和出口可以滿足不同流體的導(dǎo)入與導(dǎo)出。流體性質(zhì)的樣品從入口進(jìn)入，在主通道發(fā)生分離、混合和反應(yīng)[2]。作為實(shí)現(xiàn)微流控功能的主要部分，主通道需要根據(jù)具體功能設(shè)計結(jié)構(gòu)和尺寸。結(jié)構(gòu)最簡單的通道是平面型通道，見圖1[3]，圖1A為雙T形微流控芯片結(jié)構(gòu)簡圖，圖1B為常見的微通道布局包括了直線形、多邊形、蛇形、螺旋形、線圈形、折疊形，需要混合不同流體時則常常采用二維或三維結(jié)構(gòu)。相比而言三維結(jié)構(gòu)需要通過提供更強(qiáng)的動力來完成混合，制作工藝也更為復(fù)雜。微通道可由石英、硅、玻璃等材料制作，不同材料的利弊及適用場所也有所不同。玻璃是一種成本低、透光性強(qiáng)、絕緣性和強(qiáng)度好的材料[4]，可以及時觀察微通道內(nèi)流體狀態(tài)，適合通常的樣品分析。晶體硅制作的微流控器件有著散熱性強(qiáng)，與其他電子元件交互性好的優(yōu)勢，但硅的絕緣性和透光性較差、硅片間黏合率低等缺點(diǎn)影響了硅的應(yīng)用。目前，高分子聚合材料因其成本低、易于加工和批量生產(chǎn)，制作過程簡單而多用于較復(fù)雜通道的制備，其中以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和環(huán)狀烯烴共聚高分子(COC)最受歡迎。

注：A為雙T形微流控芯片結(jié)構(gòu)簡圖；B為常見的微通道

圖1雙T型微流控芯片結(jié)構(gòu)簡圖及常見微通道布局

現(xiàn)階段越來越多的研究者嘗試通過3D打印技術(shù)加工微流控芯片，這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展使微流控芯片制作過程更為簡便，成本低廉。目前已有研究利用微流控芯片實(shí)現(xiàn)DNA的快速分離[5]。利用微流控芯片上搭載各化學(xué)反應(yīng)，可以發(fā)展藥物方面的合成篩選。我國體外診斷主要集中在生化分析和免疫診斷上[6]，而國外歐美國家微流控片在體外診斷方面已經(jīng)取得明顯突破，通過實(shí)現(xiàn)全自動PCR分子診斷，微流控展現(xiàn)出巨大潛能[7-8]。器官芯片也是當(dāng)今的熱門研究方向，利用微流控芯片的集成功能制備器官芯片，這一技術(shù)在2016年的達(dá)沃斯論壇上入選年度十大新興技術(shù)之一。國內(nèi)已有團(tuán)隊(duì)研發(fā)出一種使多種細(xì)胞及組織在體外共存的類器官多功能微流控芯片[9]。何佳芮等[10]設(shè)計出可以聯(lián)合檢測大腸埃希菌菌體抗原及藥敏分析的微流控芯片，這種方式證實(shí)了微流控芯片制備向產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的可行性。WANG等[11]利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)作為結(jié)構(gòu)材料制備微流體結(jié)構(gòu)，通過磁性納米顆粒對樣品溶液進(jìn)行磁性捕獲，以熒光分子標(biāo)記的抗性IgG作為信號觀測，提高分析分辨率并降低了可能出現(xiàn)因表面吸附而產(chǎn)生的堵塞現(xiàn)象，整個樣品的檢測和分析都集合在一個微流體平臺上使檢測過程高效、準(zhǔn)確。JAMIE等[12]通過在一個蛋白質(zhì)芯片上集成反應(yīng)單元，可以實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)、產(chǎn)物電泳分離、組分標(biāo)記和信號檢測等連續(xù)進(jìn)行。

2 微流控技術(shù)在病原檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)病原微生物檢測主要包括涂片檢查、分離培養(yǎng)、血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，相對于微流控芯片技術(shù)，這些傳統(tǒng)檢測方法冗時費(fèi)力，而新型微流控技術(shù)現(xiàn)已在核酸分離和定量分析、DNA測序及各類病原體的檢測等方面廣泛應(yīng)用，在蛋白、氨基酸、PCR產(chǎn)物等領(lǐng)域也有了成熟的檢測技術(shù)，其基于免疫分析原理，主要以抗原、抗體和熒光靶標(biāo)為新型標(biāo)記物。在傳統(tǒng)檢測方法上發(fā)展出來的芯片大致分為兩類，電化學(xué)芯片和基因芯片[13]。電阻抗技術(shù)結(jié)合微通道制作而成的電化學(xué)微流控芯片，是通過在芯片上自動集成化操作，可以高效準(zhǔn)確地收集數(shù)據(jù)，由于電化學(xué)傳感器在結(jié)構(gòu)設(shè)計和性能與微流控芯片相匹配，這種電化學(xué)微流控芯片更適用于即時檢測?；蛐酒臉?gòu)建，融入了微流控平臺和PCR技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)手段可以很好地解決在實(shí)際環(huán)境中面臨的問題，比如，分流協(xié)同檢測提高了樣品檢測效率并保證了檢測過程不受干擾。通過基因芯片分離擴(kuò)增基因片段，可以建立全自動微生物分型，實(shí)現(xiàn)基因芯片產(chǎn)業(yè)化，提高檢測效率。利用熒光標(biāo)記單鏈DNA來制作微流控芯片，芯片經(jīng)物理吸附待檢測樣品與單鏈DNA相結(jié)合，避免了表面處理和探針固定等繁瑣步驟，這種方式可以多通路同時檢測多種病原體，但需要通過毛細(xì)管道進(jìn)入反應(yīng)區(qū)域，所以該種芯片以濾紙作為制作材料檢測效果更為良好。

2.1細(xì)菌病原體檢測 病原微生物具有傳播性、感染性和毒力，針對各種病原微生物的特點(diǎn)，應(yīng)用在病原微生物上的微流控技術(shù)可以結(jié)合不同方法產(chǎn)生更好檢測效果。針對某種病原體在多通道微流控芯片上采用定位捕獲富集，通過熒光檢測后定量分析,這種新的試驗(yàn)方法在實(shí)際檢測中有著極大的潛在優(yōu)勢。對紙基芯片進(jìn)行等離子體處理后，紙表面上產(chǎn)生了功能性基團(tuán)醛基，以實(shí)現(xiàn)抗體的固定化。這種運(yùn)用夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析的固定化蛋白方式，建立了在紙上進(jìn)行熒光免疫測量球蛋白的新方法，相比于傳統(tǒng)方法操作更為簡便。而通過PCR檢測復(fù)雜樣品中的細(xì)菌病原體不受限于通道尺寸和形狀，對其進(jìn)行有效的DNA提取時效果顯著、結(jié)果明確，同時PCR芯片可以實(shí)現(xiàn)DNA的單分子擴(kuò)增及核酸的定量實(shí)驗(yàn)[13]。通過大量探針與不同標(biāo)記物的樣品雜交后檢出的信號強(qiáng)度，可以分析出樣本序列可實(shí)現(xiàn)病原體的檢測。鑒定細(xì)菌通常采用兩種方式，一種是傳統(tǒng)方法培養(yǎng)細(xì)菌后進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，將待測細(xì)菌放入不同生化發(fā)酵管中，觀察各發(fā)酵管的反應(yīng)確定細(xì)菌種類；另一種是病原體核酸檢測技術(shù)，多采用基于PCR的分子診斷。而新型基于微通道毛細(xì)阻力的藥敏檢測技術(shù)，通過改變流體毛細(xì)阻力通道的長度來控制液體的流速，以驅(qū)使不同種類的菌體分流向不同通道，不僅能夠?qū)?xì)菌進(jìn)行分選、培養(yǎng)和分離，同時可以對其進(jìn)行高敏度的檢測。由于芯片的簡便性及多樣性，微通道可根據(jù)病原種類的不同特點(diǎn)進(jìn)行針對性設(shè)計，XIA等[14]設(shè)計出含20個微通道芯片對多種病原菌同時檢測，部分細(xì)菌檢測的準(zhǔn)確性高達(dá)100%。如圖2A中1～8分別為加熱開關(guān)、磁球開關(guān)、通道、插頭、磁球、4個獨(dú)立反應(yīng)池、mini-Luer連接器、溫度開關(guān)，圖2B為排列成條紋粒子的微磁球芯片,圖2C為混合磁粉的芯片,JULICH等[15]利用磁珠的磁性對捕獲的目標(biāo)DNA高效洗滌后，可檢測出水體表面的蘇云金桿菌和土拉熱桿菌。通過運(yùn)用液滴及介電泳技術(shù)實(shí)現(xiàn)高通量顆粒檢測與分選，陶冶[16]在單個液滴中實(shí)現(xiàn)一步法反轉(zhuǎn)錄的PCR擴(kuò)增,由此構(gòu)建高通量液滴的熒光信號檢測平臺,實(shí)現(xiàn)通過液滴微流控技術(shù)來準(zhǔn)確分析低拷貝數(shù)下的重組病毒。這種技術(shù)對病原體基因的特征片段進(jìn)行針對性設(shè)計和選擇，檢測其PCR產(chǎn)物，可以得到后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的多種信息，芯片中每孔可供多個不同的PCR同時進(jìn)行，具有廣泛的實(shí)用性。集毛細(xì)管電泳、熒光標(biāo)記和PCR技術(shù)于一體的微流體技術(shù)，在基因測序及表達(dá)、病原體檢測等領(lǐng)域正在高速發(fā)展，在單細(xì)胞分析方面也有著廣泛的應(yīng)用。

注：A為微流控芯片；①為加熱開關(guān)；②為磁球開關(guān)；③為通道；④為插頭；⑤為磁球；⑥為4個獨(dú)立反應(yīng)池；⑦為mini-Luer連接器；⑧為溫度開關(guān)；B圖為微磁球芯片；C為混合磁球芯片

圖2純化DNA的微流控芯片系統(tǒng)

2.2核酸檢測 核酸作為生物體基本的遺傳物質(zhì)，對核酸進(jìn)行精準(zhǔn)檢測也就是對這種病原體的分析。微流控技術(shù)對病原體核酸進(jìn)行檢測時，微通道內(nèi)施加電場產(chǎn)生能量變化，所需的試樣量少，可使分子擴(kuò)散程度低，分離效果極好，因此微流控CE分析在核酸診斷分離中的分辨能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于平板凝膠電泳。將核酸提取、PCR擴(kuò)增、分子雜交、電泳分離及檢測有機(jī)地結(jié)合在一張微芯片上，這張微芯片其快速、高質(zhì)量的分離效能在寡核苷酸、DNA、RNA片段分析及基因表型和測序應(yīng)用中可以得到充分反映。TSUKAKOSHI等[17]對特異性結(jié)合的DNA適配體進(jìn)行篩選，對得到序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析后，將序列長度進(jìn)行了優(yōu)化，通過設(shè)計芯片結(jié)構(gòu)對兩端引物序列進(jìn)行封閉，有效避免了該段序列對目標(biāo)結(jié)合時產(chǎn)生的影響。PETRALIA等[18]研制了基于硅微柱微流體裝置的生物過濾器，見圖3，微芯片從一側(cè)進(jìn)樣經(jīng)過中間層硅柱由另一側(cè)輸出，芯片由不同規(guī)格的高分子聚碳酸酯、PDMS、硅層、玻璃層構(gòu)成，用于提取乙型肝炎病毒的全基因組DNA。微流控芯片與PCR技術(shù)相結(jié)合，制作成基于磁珠提取核酸方法的微流控芯片，是將親水性陰離子交換劑預(yù)先固定在磁珠表面，利用二氧化硅顆粒來吸附帶負(fù)電荷的核酸，達(dá)到從樣品中最大程度提取和純化核酸，在引物約束下特異性地PCR擴(kuò)增。富集與蛋白質(zhì)特異性相結(jié)合的核酸，是進(jìn)一步檢測的前提及關(guān)鍵。現(xiàn)階段微流控芯片結(jié)合分子診斷技術(shù)，待檢樣品體積只需幾微升，加熱器直接集成在芯片上，可以較傳統(tǒng)PCR方法效率提高2～10倍。

圖3 硅微柱生物濾池提取核酸示意

2.3蛋白質(zhì)及其他檢測 蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行準(zhǔn)確分析可以檢測出機(jī)體的生理或病理變化。傳統(tǒng)蛋白檢測需要提取蛋白質(zhì)，對凝膠電泳分離后的蛋白區(qū)帶進(jìn)行切割、酶降解，然后用質(zhì)譜等方法檢測分析。這種傳統(tǒng)方法無法滿足現(xiàn)代科學(xué)的精準(zhǔn)、高效等需求。而隨著RNA標(biāo)記物的研究深入，檢測核糖核蛋白中的mRNA等物質(zhì)，通過流體蛋白質(zhì)的大小在時間和空間上分離病原體蛋白，是一種低成本快速檢測蛋白的方法[19-20]。將電滲流分離和紫外分光光譜檢測等技術(shù)集合在一塊小芯片上，將待檢樣品加入后，芯片自動按照設(shè)定好的檢測程序完成檢測，這種檢測手段快速，且成本低?；谖⒘骺匦酒牡鞍踪|(zhì)免疫分析方法的微反應(yīng)空間大于表面積，分子擴(kuò)散的距離減小[21-22]，使整體反應(yīng)效率大大提高。GIUFFRIDA等[23]在不同入口處加入各反應(yīng)物，在T形連接點(diǎn)形成液滴后在混合反應(yīng)區(qū)完成檢測，見圖4，通過金納米粒子增強(qiáng)出的生物發(fā)光信號與適配體相互作用結(jié)合，可將樣品體積低至1 μL并將檢測時間控制在10 min內(nèi)，其極低的檢測限也可供臨床根據(jù)所需選擇。

圖4 微流控原理圖

3 微流控技術(shù)在病原檢測領(lǐng)域的優(yōu)勢

相對于傳統(tǒng)的免疫診斷方式和病原的鑒定培養(yǎng)而言，微流控技術(shù)在病原檢測尤其是現(xiàn)場檢測方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢[24-25]。(1)自動化、污染小、更安全，樣品檢測的多個步驟集成在一張芯片上。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計采取不同微通道，使繁瑣的實(shí)驗(yàn)流程變得簡易。封閉式自動化的結(jié)構(gòu)可以保證檢測期間樣品不受污染，同時也減少對實(shí)驗(yàn)室等外在環(huán)境造成的影響，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作不受中間產(chǎn)物的影響。(2)高通量性。因?yàn)槲⑼ǖ揽梢愿鶕?jù)所需設(shè)計成三維-多通道，這種立體多元結(jié)構(gòu)可以將待檢測樣品完美分流，各通道不受其他通道影響。同一時間同一樣品可做不同項(xiàng)目檢測，與傳統(tǒng)生化檢測方法相比，極大地提高了檢測效率的同時，也保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，符合高通量操作快速、靈敏、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。(3)檢測成本低。由于系列操作集中在一塊小芯片上，各個結(jié)構(gòu)單元微小，所需的檢測試劑和待檢樣品消耗量自然隨之減少。盡管檢測試劑濃度可能增大，但實(shí)際使用量要遠(yuǎn)小于常規(guī)檢測方法，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本也避免造成浪費(fèi)。因?yàn)樽詣踊胁僮鳎璞粰z測的樣本量只需要微升甚至納升級別。隨著微流控技術(shù)的進(jìn)步，產(chǎn)業(yè)化商業(yè)化的發(fā)展，一塊微芯片的成本控制在可接受范圍將逐步實(shí)現(xiàn)。

正因?yàn)槲⒘骺鼐哂幸陨蠋讉€重要的優(yōu)勢和優(yōu)點(diǎn)，使其成為了即時檢驗(yàn)(POCT)的首選，并在臨床檢測中逐漸推行開來。

4 存在的問題和發(fā)展趨勢

微流控技術(shù)可極大地縮短樣品處理時間，通過精密控制液體流動，最大化地利用試劑耗材，把整個化驗(yàn)室的功能集成在微芯片上，為病原微生物檢測等領(lǐng)域提供了無限的前景。盡管微流控可以大幅度降低試樣和試劑的消耗，但因其昂貴的制作成本和復(fù)雜的制作工藝使這項(xiàng)技術(shù)并不能很好地應(yīng)用在臨床實(shí)際檢測中，同時制作微芯片的方法和基底材質(zhì)受限過大，對于操作人員的技術(shù)要求較高?，F(xiàn)階段隨著各項(xiàng)學(xué)科研究的深入，生物芯片將得到更為廣泛的應(yīng)用，新興的數(shù)字微流控技術(shù)(DMF)在行業(yè)內(nèi)引起廣泛關(guān)注，這種可實(shí)現(xiàn)離散液滴精準(zhǔn)自動化操縱的新型液滴操縱技術(shù)對于檢測樣品具有十分重要的意義。同時，微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)是指尺寸在幾毫米甚至更小的高科技裝置，因其融合了精密機(jī)械加工、薄膜和硅加工等多項(xiàng)技術(shù)，期待微機(jī)電系統(tǒng)在微流控芯片小型化中帶來的新研究思路。