高艷飛

(遼河油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧盤錦 124010)

糖尿病腎病(DKD)是糖尿病患者常見并發(fā)癥之一。我國DKD的發(fā)病率呈不斷上升之勢，研究顯示20%～45%的糖尿病患者存在不同程度的腎臟損傷，如不及早干預(yù)將進(jìn)展為終末期腎病[1-2]。有關(guān)DKD具體發(fā)病機(jī)制和病理基礎(chǔ)尚未完全闡明，越來越多的證據(jù)表明炎性反應(yīng)和腎臟氧化應(yīng)激損傷是引起DKD發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[3-4]。有關(guān)miRNA在DKD發(fā)病過程中發(fā)揮的作用逐漸引起眾多學(xué)者的重視。近年來研究發(fā)現(xiàn)miR-146a的表達(dá)在合并周圍神經(jīng)病變、糖尿視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥的糖尿病患者中發(fā)生改變[5-6]。本研究主要分析DKD模型大鼠血清miR-146a的表達(dá)，及其與大鼠炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD雌雄大鼠100只，體質(zhì)量203～215 g，購自中國科學(xué)院斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心(SCXK京2011-0012)，購回后適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后再用于實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組(n=50)和模型組(n=50)。

1.2儀器與試劑 鏈脲佐菌素(Sigma公司，美國)；TRIzol總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABI Applied Biosystems，美國)；RT-PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和高級氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(美國R&D Systems公司)；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)檢測試劑(上海銘博生物科技有限公司)；TBA-40FR全自動生化分析儀(日本東芝公司)；尿清蛋白放射免疫測定試劑盒(中國原子能科學(xué)院同位素研究所)。

1.3DKD大鼠模型構(gòu)建 對照組和模型組分別給予基礎(chǔ)飼料和高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料64%、豬油8%、蛋黃粉9%、蔗糖18%、膽酸鈉1%)喂養(yǎng)。8周后，模型組大鼠采用無菌枸櫞酸鈉緩沖液配制的鏈脲佐菌素(40 mg/kg)行腹腔注射，對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，分別予以之前的飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周。4周后，采集大鼠尾靜脈血，TBA-40FR全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FPG)；代謝籠留取24 h尿液，采用放射免疫法測定尿清蛋白水平(μg/mL)，計算24 h尿蛋白排泄率(UAER，μg/min)=尿清蛋白水平×24 h尿液總量(mL)/60 min×24 h。若空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，UAER>30 mg/24 h，則視為造模成功。

1.4RT-PCR檢測血清miR-146a表達(dá) 采集2組大鼠尾靜脈血，TRIzol法提取血清總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物miR-146a上游：5′-GGG TGA GAA CTG AAT TCC A-3′，下游：5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。U6上游：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃,10 min；95 ℃,15 s；60 ℃,15 s；72 ℃,15 s；55 ℃,15 s；共計40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)(RQ)，RQ=2-ΔΔCt。

1.5炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 采集2組大鼠尾靜脈血，采用ELISA法測定NF-κB、TNF-α、IL-1β、AOPPs水平。采用硫代巴比妥酸法和化學(xué)比色法測定MDA和SOD水平。

2 結(jié) 果

2.1血清miR-146a表達(dá)比較 對照組和模型組大鼠血清miR-146a表達(dá)量分別為23.14±5.81、14.67±4.59，模型組大鼠血清miR-146a表達(dá)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.720，P<0.05)。

2.22組血清NF-κB、TNF-α和IL-1β水平比較 模型組大鼠血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.32組血清SOD、MDA和AOPPs水平比較 模型組大鼠血清MDA和AOPPs水平明顯高于對照組，SOD水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組血清NF-κB、TNF-α 和IL-1β水平比較

表2 2組血清SOD、MDA和AOPPs水平比較

2.4miR-146a與各指標(biāo)的相關(guān)分析 模型組大鼠血清miR-146a與NF-κB、TNF-α、IL-1β、MDA和AOPPs呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與SOD呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 miR-146a表達(dá)與各指標(biāo)的相關(guān)分析

3 討 論

miR-146a定位于人類基因染色體的5q34位點(diǎn)上，是一個典型的多靶基因調(diào)節(jié)器。已有研究顯示miR-146a在糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥患者中的表達(dá)下降[5-6]。那么miR-146a在DKD發(fā)生、發(fā)展中扮演何種角色？miR-146a與慢性炎性反應(yīng)和腎臟氧化應(yīng)激損傷之間又存在何種聯(lián)系？目前仍鮮有文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清miR-146a表達(dá)明顯低于對照組，這說明miR-146a可能在DKD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

NF-κB信號通路是重要的炎性反應(yīng)通路，在免疫應(yīng)答、炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡等多種過程中發(fā)揮調(diào)控作用。TAGANOV等[7]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在TNF-α 和IL- 1β等刺激下，通過NF-κB 通路上調(diào)miR-146a表達(dá)；而miR-146a反過來通過TNF受體相關(guān)因子6(TRAF6)和IL-1受體相關(guān)激酶1(IRAK1)，減少下游IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而形成一個負(fù)反饋調(diào)控過程。此外，HE等[8]學(xué)者證實(shí)，miR-146a是Notch的直接靶基因，可通過Notch信號通路途徑調(diào)控其下游各種炎癥因子的表達(dá)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清NF-κB、TNF-α和IL-1β的水平均明顯高于對照組，相關(guān)性分析顯示模型組大鼠血清miR-146a表達(dá)與NF-κB和TNF-α呈負(fù)相關(guān)。這也進(jìn)一步證實(shí)了miR-146a可通過調(diào)節(jié)NF-κB及其下游炎癥因子的表達(dá)參與DKD的發(fā)生、發(fā)展。

氧化應(yīng)激損傷在DKD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。高糖誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，導(dǎo)致ROS生成和清除失衡[9-10]。一方面，ROS增加會導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜上的負(fù)電荷丟失，破壞腎小球?yàn)V過屏障，帶負(fù)電荷的清蛋白易于從腎小球?yàn)V過膜溢出。長期蛋白尿會導(dǎo)致腎小球和腎小管損傷。另一方面，ROS引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，致使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物蓄積，引起腎臟損傷。SOD、MDA和AOPPs是評價機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)的常用指標(biāo)，其水平反映了機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重程度。血清miR-146a表達(dá)變化與機(jī)體氧化應(yīng)激損傷之間存在何種聯(lián)系？尹斌等[11]學(xué)者研究顯示，miR-146a可減輕過氧化氫所致人胃腺癌細(xì)胞株的氧化應(yīng)激損傷，過表達(dá)miR-146a可明顯增加細(xì)胞SOD活力，減少M(fèi)DA水平。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清MDA和AOPPs水平明顯高于對照組，SOD水平明顯低于對照組，說明模型組大鼠存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎臟氧化應(yīng)激損傷可能是導(dǎo)致DKD發(fā)生、發(fā)展的重要原因。

綜上所述，DKD大鼠血清miR-146a表達(dá)降低，可能參與了炎性反應(yīng)和腎臟氧化應(yīng)激損傷，從而參與DKD的發(fā)生、發(fā)展。miR-146a有望成為DKD的潛在分子標(biāo)志物之一，從而指導(dǎo)疾病的診斷和治療。