李 敏,韓笑杰

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,杭州 310014)

前列腺特異抗體(PSA)是一種hKLK3基因編碼，由前列腺上皮細(xì)胞分泌的單鏈糖蛋白，主要被分泌到前列腺液中，水解精液凝固蛋白，使精液液化。PSA在前列腺中水平較高，在血清中水平則較低。前列腺癌患者的血清中可檢測(cè)到較正常值略高的PSA。PSA作為前列腺癌的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于前列腺癌的預(yù)防、治療和預(yù)后有重要作用。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)雙抗體夾心法檢測(cè)技術(shù)，目前從男性血清中可檢測(cè)到0～4 ng/mL的PSA，當(dāng)PSA水平更低時(shí)，由于ELISA信號(hào)檢測(cè)靈敏度較低，就無(wú)法檢測(cè)。本研究改良ELISA最后一步的信號(hào)放大系統(tǒng)，使信號(hào)發(fā)生與過(guò)氧化氫減少導(dǎo)致的納米膠體金顏色的變化聯(lián)系在一起，實(shí)現(xiàn)用肉眼來(lái)觀(guān)測(cè)檢測(cè)結(jié)果。由于應(yīng)用了納米技術(shù)，使檢測(cè)信號(hào)更加靈敏。

1 材料與方法

1.1材料 實(shí)驗(yàn)使用的生化試劑三水合氯金酸、30%H2O2、蔗糖、BSA均購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。ELISA緩沖液購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。PSA標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。ELISA使用的鼠抗PSA單克隆抗體、兔抗PSA、生物素修飾羊抗兔IgG和鏈霉親和素-HRP均購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司。實(shí)驗(yàn)使用的SC-T45分光光度計(jì)購(gòu)自光量國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.2方法

1.2.1納米金膠體顏色變化的H2O2臨界值研究 H2O2是一種既具有氧化性，又具有還原性的物質(zhì)。H2O2具有強(qiáng)氧化性，充足的 H2O2可以將氯金酸中的金離子還原為納米金顆粒，納米金粒徑較小，分布均勻，反應(yīng)液呈紅色。H2O2制備納米金的反應(yīng)是可逆的。當(dāng)反應(yīng)液中的H2O2水平降低時(shí)，已經(jīng)形成的納米金膠體會(huì)發(fā)生聚集，形成較大顆粒，其折射光線(xiàn)的能力瞬間發(fā)生改變，溶液就會(huì)從紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。由于納米金顏色的轉(zhuǎn)變?nèi)Q于納米金顆粒的大小，極微弱的H2O2水平改變就會(huì)導(dǎo)致納米金顆粒大小的變化，從而導(dǎo)致顏色的變化。測(cè)定導(dǎo)致顏色發(fā)生瞬變的H2O2臨界值水平，是實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)的關(guān)鍵步驟。

實(shí)驗(yàn)全過(guò)程都需要添加膠體金顆粒的保護(hù)劑，以維持膠體金的穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)選取蔗糖作為保護(hù)劑，研究H2O2產(chǎn)生納米金顏色變化的臨界值。具體方法：將三水合氯金酸溶解在蔗糖(0.2 mmol/L,pH6.5)中，制備0.1 mmol·Lol-1·L-1的氯金酸溶液。酶標(biāo)板用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，然后用去離子水洗2次，在酶標(biāo)板中加入不同水平的H2O2，使終水平為0、20、40、60、80、100、120 μmol/L，每個(gè)相鄰孔的差值在20 μmol/L。然后在酶標(biāo)板每個(gè)孔中加入0.1 mmol/L的氯金酸溶液。該方法研究H2O2導(dǎo)致變色的臨界水平和差值，評(píng)價(jià)檢測(cè)系統(tǒng)的可行性和靈敏度。孔中的樣品顯色后，用光度計(jì)測(cè)定每個(gè)孔中液體的最大吸收波長(zhǎng)。納米金膠體在穩(wěn)定的狀態(tài)下，最大吸收波長(zhǎng)在550 nm，呈現(xiàn)紅色。當(dāng)納米金發(fā)生聚集，顆粒變大時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生紅移，波長(zhǎng)將大于550 nm。臨界值認(rèn)定為H2O2的終水平(加入等體積氯金酸后稀釋1倍)，而不是加入量。

1.2.2前列腺癌標(biāo)志物PSA的可視化檢測(cè) H2O2水平的改變可以引起納米金顏色的改變，獲得H2O2臨界值核心數(shù)據(jù)后，即可設(shè)計(jì)PSA的可視化檢測(cè)方法。前面的步驟與ELISA雙抗體夾心方法一致。在最后的信號(hào)放大時(shí)，當(dāng)測(cè)試樣品有PSA時(shí)，處于臨界值的H2O2會(huì)被鏈霉親和素-HRP消耗，與H2O2水平密切相關(guān)的納米金粒徑發(fā)生改變，顏色就會(huì)從紅色變?yōu)樗{(lán)色，實(shí)現(xiàn)PSA的可視化檢測(cè)。操作方法：96孔酶標(biāo)板加入鼠抗PSA的單克隆抗體100 μL，用PBS 按照1∶1 000稀釋?zhuān)? ℃包埋過(guò)夜。洗滌液洗板3次后，用封閉液[標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(BSA)溶解于PBS]，室溫封閉1 h。洗滌液洗板3次，加入用BSA稀釋的不同水平PSA標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，室溫反應(yīng)2 h。洗滌液洗板3次，加入兔抗PSA，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應(yīng)2 h。洗滌液洗板3次，加入生物素修飾羊抗兔IgG 100 μL，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應(yīng)1 h。洗滌液洗板3次，加入鏈霉親和素-HRP結(jié)合物100 μL，用封閉液稀釋1∶1 000，室溫反應(yīng)30 min。洗滌液洗3次，PBS洗2次，去離子水洗2次，加入200 μmol·Lol-1·L-1H2O2100 μL，室溫反應(yīng)30 min后，加入新鮮配制的0.1 mmol·Lol-1·L-1氯金酸溶液100 μL。30 min后，觀(guān)察酶標(biāo)板孔中的顏色變化。PSA標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋水平為10-8、10-9、10-10、10-11、10-12g/mL。實(shí)驗(yàn)對(duì)照品為BSA，操作步驟與PSA的一致。

2 結(jié) 果

2.1H2O2臨界值的測(cè)定 當(dāng)H2O2水平高于100 μmol/L時(shí)，孔中溶液呈現(xiàn)紅色，其最大吸收波長(zhǎng)經(jīng)測(cè)定在550 nm左右，見(jiàn)圖1。當(dāng)H2O2水平小于100 μmol/L時(shí)，肉眼可以清晰辨認(rèn)為藍(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，經(jīng)測(cè)定在580 nm左右，見(jiàn)表1。

注：①～⑤實(shí)際為紅色；⑥～⑦實(shí)際為藍(lán)色

圖1不同H2O2水平反應(yīng)的膠體金顏色轉(zhuǎn)變

表1 不同H2O2水平反應(yīng)的膠體金的光學(xué)性質(zhì)研究

2.2前列腺癌標(biāo)志物PSA的測(cè)定 通過(guò)檢測(cè)不同的PSA水平，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PSA水平為10-8、10-9、10-10g/mL時(shí)，都顯示出藍(lán)色，當(dāng)水平為10-11、10-12g/mL時(shí)，顯示紅色，見(jiàn)圖2。以BSA作為對(duì)照，所有水平結(jié)果均顯示為紅色。

注：①～③實(shí)際為紅色；④～⑩實(shí)際為藍(lán)色

圖2 PSA可視化檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)H2O2水平高于100 μmol/L時(shí)，加樣孔中的氯金酸在H2O2的還原作用下，全部都轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的膠體金顆粒，呈現(xiàn)紅色，其最大吸收波長(zhǎng)經(jīng)測(cè)定在550 nm左右。當(dāng)H2O2水平小于100 μmol/L時(shí)，肉眼可以清晰辨認(rèn)為藍(lán)色，其最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移，經(jīng)測(cè)定在580 nm左右。因此確定發(fā)生顏色變化的H2O2臨界值為100 μmol/L，實(shí)現(xiàn)顏色轉(zhuǎn)變的差值為20 μmol/L，差值的水平區(qū)間很小，提示新型檢測(cè)方法的靈敏度較高。H2O2臨界值的測(cè)定為設(shè)計(jì)可視化檢測(cè)方法，提供了重要的數(shù)據(jù)支持。使用雙抗體夾心法對(duì)PSA進(jìn)行檢測(cè)，前期步驟與常規(guī)ELISA相同，在最后一步的顯色反應(yīng)中，用辣根過(guò)氧化物酶去作用處于顯色臨界值的H2O2。這樣，如果檢測(cè)體系中存在PSA，檢測(cè)系統(tǒng)就會(huì)存在消耗H2O2，微量H2O2水平的改變就會(huì)引起顏色變化。表明該種檢測(cè)方法的PSA最低檢測(cè)限為10-10g/mL，比目前臨床上使用的PSA ELISA試劑盒靈敏度要高。由于檢測(cè)系統(tǒng)應(yīng)用了雙抗體夾心法，包埋抗體為抗PSA的單克隆抗體，檢測(cè)的準(zhǔn)確率也較高?？梢暬瘷z測(cè)技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需使用酶標(biāo)儀，直接用肉眼就可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察，適用于普通實(shí)驗(yàn)室。

腫瘤的早期檢測(cè)是治愈腫瘤的最佳手段[1-2]。在臨床上，腫瘤標(biāo)志物PSA的檢測(cè)對(duì)前列腺癌的早期診斷、治療和預(yù)后具有重要的意義[3-6]。目前使用的ELISA試劑盒檢測(cè)血清PSA水平靈敏度較低，有假陽(yáng)性、倒鉤現(xiàn)象，這些缺陷都是使用酶標(biāo)儀引起的[7-8]。HAESE等[9]在臨床上檢測(cè)PSA，應(yīng)用普通ELISA技術(shù)，可以檢測(cè)的PSA水平為4 ng/mL。KOBORI等[10]在臨床上檢測(cè)PSA，應(yīng)用普通ELISA技術(shù)，可以檢測(cè)的PSA水平為2 ng/mL。本文所構(gòu)建的可視化檢測(cè)系統(tǒng)可以作為檢測(cè)PSA的有效檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.1 ng/mL，要比HAESE等[9]和KOBORI等[10]的檢測(cè)結(jié)果靈敏20～40倍。可視化檢測(cè)技術(shù)無(wú)需使用酶標(biāo)儀，因此克服了由酶標(biāo)儀引起的ELISA倒鉤、假陽(yáng)性等檢測(cè)缺陷?？梢暬瘷z測(cè)技術(shù)由于不需使用昂貴的檢測(cè)儀器，通過(guò)肉眼觀(guān)察顏色改變判定檢測(cè)結(jié)果，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，檢測(cè)費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。改變的顏色色系為從紅色變?yōu)樗{(lán)色。未超標(biāo)樣品的檢測(cè)結(jié)果為紅色，如果樣品中的腫瘤標(biāo)志物超標(biāo)，則呈現(xiàn)藍(lán)色。紅色轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色肉眼極易察覺(jué)。因此，這是一種設(shè)定了某個(gè)標(biāo)準(zhǔn)值后，界定是否超標(biāo)的檢測(cè)技術(shù)。當(dāng)需要調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)值時(shí)，只需對(duì)樣品的稀釋度進(jìn)行調(diào)整就可以。當(dāng)然，該方法也具有一定的局限性，該方法只能針對(duì)最低檢測(cè)限度做出定性的檢測(cè)，而不能對(duì)單一樣品的水平進(jìn)行精確的測(cè)定。

腫瘤標(biāo)志物可視化檢測(cè)技術(shù)只需肉眼觀(guān)察就可判斷結(jié)果，無(wú)需使用儀器，檢測(cè)成本低，可以應(yīng)用于貧困地區(qū)及條件差的實(shí)驗(yàn)室。該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用納米材料的顏色變化來(lái)設(shè)計(jì)信號(hào)傳遞方式。這種基于納米反應(yīng)的生物信號(hào)傳遞方式較ELISA發(fā)光機(jī)制能使生物信號(hào)最大限度地放大。因此，腫瘤標(biāo)志物可視化檢測(cè)技術(shù)靈敏度極高，某些由于水平低而無(wú)法檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物可以被測(cè)定，為檢測(cè)多種腫瘤的腫瘤標(biāo)志物復(fù)合物篩查創(chuàng)造條件。已能檢測(cè)的腫瘤標(biāo)志物當(dāng)提高檢測(cè)靈敏度后，腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)水平可以進(jìn)一步降低，使已經(jīng)發(fā)生腫瘤但由于腫瘤標(biāo)志物水平低而檢測(cè)為假陰性的患者，能夠在腫瘤早期做出診斷，減少假陰性的發(fā)生率。

綜上所述，腫瘤標(biāo)志物可視化檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，可廣泛應(yīng)用于貧困地區(qū)居民和普通人群的腫瘤篩查，從而大幅度提高我國(guó)腫瘤早期診斷率，使大量腫瘤患者能在早期得到有效治療，延長(zhǎng)生存時(shí)間，為真正征服惡性腫瘤帶來(lái)希望。該項(xiàng)技術(shù)既能提高公民的健康水平和生活質(zhì)量，又能節(jié)約國(guó)家醫(yī)療資源和投入，具有較好的社會(huì)效益。