彭 玲

(宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春 336000)

黃酮類化合物是指由2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相連接構(gòu)成的一系列化合物[1]，用C6—C3—C6表示。有研究表明，黃酮類化合物大多與糖結(jié)合成苷，少部分以游離形式存在[2-3]。大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物，它對植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果等方面有很重要的作用。直到20世紀60年代末，人們發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有利膽、強心、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗菌、抗癌、抗心腦血管疾病、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能及藥理作用[4]，因此其提取物已被廣泛應用于食品、藥品、化妝品等產(chǎn)品中。

有關(guān)報道顯示，油茶總皂苷分子極性較強，具有抗氧化、清除自由基的能力，但從油茶殼中提取總黃酮及其抑菌活性的研究至今較少。油茶是我國南方重要的木本油料作物，廣泛分布于江西、湖南、福建、廣東、廣西等省(自治區(qū))，資源十分豐富。據(jù)統(tǒng)計全國有油茶367萬hm2，每年產(chǎn)油15億kg，同時將產(chǎn)生100億kg的油茶果殼[5]。本著變廢為寶的原則，如果能將數(shù)量如此龐大的油茶殼加以有效利用，將帶來巨大的經(jīng)濟效益，因此充分利用油茶殼中的黃酮類化合物具有十分重要的現(xiàn)實意義。

本試驗針對油茶殼中總黃酮酶解-超聲提取工藝進行研究，利用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預處理原料油茶殼[6]，然后采用單因素試驗，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時間為顯著因素，采用響應面法摸索出對油茶殼總黃酮化合物提取的最佳條件，并研究其抑菌活性，旨在為油茶殼總黃酮化合物的深度開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)天然抑菌劑提供理論依據(jù)和方法指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶殼，購自江西省宜春市油茶園，除雜清洗后自然風干，粉碎過80目篩。

無水乙醇，購自廣州雙船化學試劑廠；蕓香苷標準品，購自中國藥品生物制品檢定所；纖維素酶、蛋白酶、果膠酶，購自諾維信生物技術(shù)有限公司；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，購自廣州味研生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FW135中草藥粉碎機，購自上海隆拓儀器設備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自國華電器有限公司；DL-1000A超聲波清洗器，購自上海之信儀器有限公司；UV-5100紫外可見分光光度計，購自上海元析儀器有限公司；CJ系列垂直、水平單向流凈化工作臺，購自蘇州華宏凈化技術(shù)有限公司；YHR-250生化培養(yǎng)箱，購自上海姚氏儀器設備廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程 纖維素酶、蛋白酶、果膠酶+原料→預處理→超聲提取→抽濾→濾液定容→測總黃酮含量。

1.3.2 酶解預處理[7]通過對油茶殼組成成分分析，可知油茶殼中含有大量的纖維素、蛋白質(zhì)、果膠等成分，因此采用一定量的纖維素酶、蛋白酶、果膠酶按照一定比例互配，對原料油茶殼進行預處理，以提高油茶殼中總黃酮的提取率。

1.3.3 標準曲線的繪制[8]在波長為400～800 nm范圍內(nèi)做波長掃描，結(jié)果表明蕓香苷在508 nm處有最大吸光度，且空白對照干擾最小。因此，在蕓香苷的最大吸收波長508 nm處測定吸光度。通過標準曲線的制作，得到回歸方程y=123.82x-0.018 1(r2=0.999 0)計算總黃酮的含量。

1.3.4 單因素試驗條件

1.3.4.1 超聲功率的影響[9]稱取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預處理，采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為30 mL ∶1 g，提取時間為30 min，超聲功率為200、250、300、350、400 W等5個水平進行研究，以探討超聲功率對油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.2 乙醇濃度的影響[10]稱取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預處理，采用超聲功率為200 W，液料比為30 mL ∶1 g，提取時間為30 min，乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%等5個水平進行研究，以探索乙醇濃度對油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.3 提取時間的影響[11]稱取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預處理，采用50%乙醇為提取溶劑，液料比為30 mL ∶1 g，超聲功率為200 W，提取時間為30、40、50、60、70 min等5個水平進行研究，以探索提取時間對油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.4.4 液料比的影響[12-13]稱取1 g油茶殼粉末，經(jīng)纖維素酶、蛋白酶、果膠酶預處理，采用50%乙醇為提取溶劑，超聲功率200 W，提取時間為30 min，液料比為20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g、60 mL ∶1 g等5個水平進行研究，以探索液料比對油茶殼總黃酮提取效果的影響。

1.3.5 響應面試驗設計[14-15]根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時間為主要影響因素，以油茶殼總黃酮溶出率作為評價指標，進行3因素3水平響應面分析。試驗設計的水平及編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平編碼

1.4 總黃酮溶出率[16-17]

1.5 油茶殼總黃酮的抑菌活性[18]

分別將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行接種活化，用無菌水制成一定濃度的細菌懸浮液，稀釋備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對黃酮超聲提取率的影響

2.1.1 超聲功率的影響 在其他提取工藝條件一定時，考察超聲功率對黃酮超聲提取效果的影響。由圖1可知，當超聲功率為250 W時，總黃酮提取效果最好，但當功率再增大時提取效果反而下降，這可能是由于當功率增大到一定程度時，生成的黃酮類化合物會被再水解成其他的物質(zhì)或是功率過大會對黃酮分子產(chǎn)生破壞作用。說明超聲功率對總黃酮溶出率的影響是雙向性的，既有正效應又有負效應，試驗中應避免超聲功率過大而引起提取率下降。綜合考慮后，選擇功率為200、250、300 W繼續(xù)對油茶殼總黃酮超聲提取作響應面分析，以確定最佳的超聲功率。

2.1.2 乙醇濃度的影響 在其他提取工藝條件一定時，考察乙醇濃度對黃酮超聲提取效果的影響。由圖2可知，總黃酮的提取效果隨著乙醇濃度的升高而增大，而后又變小。當乙醇濃度為40%時，總黃酮的提取效果最好。根據(jù)相似相溶原理，極性相似可達到最大溶出度，即油茶殼總黃酮與40%乙醇極性相似。綜合考慮后，選擇乙醇濃度為30%、40%、50%繼續(xù)對油茶殼總黃酮超聲提取作響應面分析，以確定最佳的乙醇濃度。

2.1.3 提取時間的影響 在其他提取工藝條件一定時，考察提取時間對黃酮超聲提取效果的影響。由圖3可知，開始時總黃酮提取效果隨著提取時間的延長而增大，提取時間達到60 min時，總黃酮提取效果最佳，之后總黃酮提取效果有所下降。分析其原因可能是由于時間過短產(chǎn)物溶出不充分，而提取時間過長，超聲波對總黃酮的提取結(jié)果有所破壞，引起產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的分解而使提取效果下降。綜合考慮后， 選擇提取時間為50、60、70 min繼續(xù)對油茶殼總黃酮超聲提取作響應面分析，以確定最佳的提取時間。

2.1.4 液料比的影響 在其他提取工藝條件一定時，考察液料比對黃酮超聲提取效果的影響。由圖4可知，總黃酮提取效果隨著液料比的增大而增大，當液料比到達40 mL ∶1 g時，吸光度達到最高值，隨后呈下降趨勢。從整體提取率上看，不同液料比的溶出率差別并不多。綜合考慮后，液料比不作為響應面法的主要影響因素。

2.2 響應面法優(yōu)化油茶殼黃酮提取工藝條件

2.2.1 響應面試驗設計與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗設計原理，同時綜合考慮單因素試驗分析結(jié)果，確定超聲功率、乙醇濃度、提取時間3個因素為總黃酮溶出率的顯著影響因素，以油茶殼總黃酮溶出率為響應值(Y)，設計3因素3水平的響應面分析試驗，其響應面分析方案及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中的各組數(shù)據(jù)進行響應面回歸后擬合方程，得Y=2.28+0.049A+0.075B-0.029C+7.5×10-3AB-0.019AC+8.175×10-3BC-0.34A2-0.53B2-0.078C2，并進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。其中，Y為油茶殼總黃酮含量的預測值；A、B、C分別為上述超聲功率、乙醇濃度、提取時間的編碼值。

表2 響應面分析方案及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

2.2.2 各因素之間的交互作用 用Design-Expert 8.0.6軟件處理的響應面分析結(jié)果見圖5至圖7。

通過Design-Expert8.0.6軟件分析，將3因素互相進行分析比較，作出響應面曲線圖。等高線即為響應面圖在底面的投影，其形狀反映了交互影響的強弱。等高線趨于圓形時，2因素的交互作用相對較弱；等高線呈橢圓形時，2因素的交互作用相對較強。由圖5至圖7可知，超聲功率和乙醇濃度的等高線、超聲功率和提取時間的等高線、乙醇濃度和提取時間的等高線均為圓形，說明它們之間的交互作用不明顯。

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析所得回歸模型方程，得到最佳提取工藝：超聲功率為253.94 W，乙醇濃度為 40.7%，提取時間為58.07 min。但考慮到實際情況，將最佳提取工藝條件參數(shù)修正為超聲功率為255 W，乙醇濃度為41%，提取時間為58 min。為檢驗響應面法優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用修正的最佳提取條件，經(jīng)過3次平行驗證試驗，得到油茶殼總黃酮溶出率為2.652 3%，為試驗中最大值，同時該試驗值與預期值吻合良好。

2.3 油茶殼總黃酮的抑菌活性

由表4可知，油茶殼總黃酮提取物對試驗菌種枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有明顯抑制作用，并且抑菌效果為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌。

3 結(jié)論

本試驗利用酶解-超聲波法提取油茶殼總黃酮，通過單因素試驗發(fā)現(xiàn)，超聲功率、乙醇濃度、超聲時間、液料比等4個因素均對總黃酮溶出率有一定程度的影響。通過篩選確定超聲功率、乙醇濃度、超聲時間為主要影響因素。通過Box-Behnken試驗設計建立提取油茶殼總黃酮的優(yōu)化回歸方程模型，經(jīng)過方差分析該模型與實際試驗擬合良好。因變量與自變量之間具有顯著線性關(guān)系，可以替代試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析。最佳提取工藝條件：超聲功率為255 W，乙醇濃度為41%，提取時間為58 min。驗證試驗得到油茶殼總黃酮溶出率為2.652 3%，為試驗中的最大值，同時該試驗值與預期值吻合良好。油茶殼總黃酮提取物有抑菌活性，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑制作用明顯。

表4 油茶殼總黃酮的抑菌圈直徑