張 錚， 石青松， 朱偉云， 毛勝勇

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/江蘇省消化道營(yíng)養(yǎng)與動(dòng)物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210095)

近年來(lái)，隨著歐盟和許多國(guó)家開(kāi)始限制和禁用抗生素，尋找高效安全的飼用抗生素替代品已成為畜牧業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。目前，微生態(tài)制劑和發(fā)酵飼料被認(rèn)為是最有希望的飼用抗生素替代品，但在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑實(shí)際應(yīng)用效果不穩(wěn)定，且其產(chǎn)品的貨架期較短。發(fā)酵飼料作為一種綠色、環(huán)保的新型飼料，目前已成為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究熱點(diǎn)。在眾多發(fā)酵飼料中，乳酸菌發(fā)酵飼料因具有替代或部分替代抗生素的潛力而受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵飼料不僅含有大量活性益生菌，還含有大量的益生素等活菌與代謝產(chǎn)物[1]，同時(shí)乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中還可以消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，將大分子蛋白分解為活性肽或游離氨基酸，對(duì)飼料起到預(yù)消化作用[2]。此外，乳酸菌還是多種動(dòng)物消化道的共生菌，乳酸菌進(jìn)入動(dòng)物腸道后，可使動(dòng)物腸道中有益菌數(shù)量增加，促進(jìn)腸道內(nèi)形成有益優(yōu)勢(shì)菌群，從而競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原微生物增殖，保持腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，并對(duì)機(jī)體免疫起到積極調(diào)節(jié)作用[3]?；谝陨涎芯窟M(jìn)展，本研究擬采用本試驗(yàn)室分離獲得的1株具有產(chǎn)乳酸能力和抗逆性強(qiáng)的唾液乳桿菌，進(jìn)行全價(jià)飼料固態(tài)發(fā)酵，研究該乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬的生長(zhǎng)性能和小腸發(fā)育情況的影響，為該發(fā)酵飼料在仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

試驗(yàn)于2014年12月至2015年1月在江蘇省南京市浦口區(qū)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物養(yǎng)殖基地進(jìn)行，選取48頭28日齡、體況良好、體質(zhì)量相近的杜長(zhǎng)大三元雜交斷奶仔豬，隨機(jī)分為2組，每組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6頭豬，試驗(yàn)周期為29 d，試驗(yàn)開(kāi)始前3 d為預(yù)飼期。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)豬飼養(yǎng)于保育舍內(nèi)，每個(gè)保育床為1個(gè)重復(fù)，每天喂料3次，自由采食，自由飲水，保證通風(fēng)換氣，室內(nèi)溫度保持在15～20 ℃，免疫程序按養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)常規(guī)進(jìn)行。在預(yù)飼養(yǎng)期間，每日統(tǒng)計(jì)飼料消耗和健康狀況，掌握仔豬采食量變化，同時(shí)觀察豬的行為和健康狀況。預(yù)試期結(jié)束后，稱試驗(yàn)豬質(zhì)量并進(jìn)行調(diào)整，統(tǒng)計(jì)后各組體質(zhì)量無(wú)顯著差異時(shí)進(jìn)入正式試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)日糧

對(duì)照組飼喂無(wú)抗乳豬全價(jià)配合飼料，試驗(yàn)組飼喂添加20%乳酸菌發(fā)酵飼料的無(wú)抗乳豬全價(jià)配合飼料(表1)。

表1 試驗(yàn)日糧配方及營(yíng)養(yǎng)成分

注：預(yù)混料為全價(jià)飼料提供250 g/kg豬復(fù)合微量元素、35 g/kg乳豬用多維素、120 g/kg氯化膽堿(50%)、10 g/kg復(fù)合酶制劑、50 g/kg 甜味劑、535 g/kg載體。

1.4 樣品采集

1.4.1 糞樣采集 在屠宰前1 d以保育床為單位進(jìn)行糞樣采集，采集保育床下四角糞便，混勻后裝入10 mL滅菌離心管，冰盒保存后立即帶回試驗(yàn)室進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)分析。

1.4.2 消化道組織和內(nèi)容物的采集 取空腸、回腸、結(jié)腸段，進(jìn)行上皮分離(3 cm×3 cm)，取上皮層和部分腸段，保存在50 mL多聚甲醛溶液中，部分組織剪碎保存于滅菌凍存管；分別取各腸段內(nèi)食糜，混合均勻后保存于2 mL滅菌凍存管。同時(shí)用固體pH計(jì)測(cè)定內(nèi)容物pH值。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長(zhǎng)性能指標(biāo) 于試驗(yàn)開(kāi)始1、14、29 d晨飼前空腹稱質(zhì)量，計(jì)算平均日增重。

1.5.2 免疫器官指數(shù) 分別采集脾臟、肝臟、腎臟，稱取其濕質(zhì)量，計(jì)算免疫器官指數(shù)[4]。

脾臟(腎臟、肝臟)指數(shù)(g/kg)=脾(腎臟、肝臟)濕質(zhì)量/豬活體質(zhì)量。

1.5.3 胃腸道食糜pH值與回腸、結(jié)腸內(nèi)容物揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，簡(jiǎn)稱VFA)含量測(cè)定 采用Walk LAB pH60型酸度計(jì)測(cè)量各腸段食糜pH值。取1 g內(nèi)容物分別加入1 mL無(wú)菌蒸餾水，充分振蕩成懸濁液，在4 ℃、5 000g離心10 min，取上清液0.5 mL加25%偏巴酸0.1 mL搖勻過(guò)夜。上機(jī)前，在4 ℃、10 000g離心10 min，用氣相色譜儀測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸等含量，具體方法參照文獻(xiàn)[5]。

1.5.4 空腸和回腸絨毛形態(tài) 固定后的腸道組織樣品經(jīng)脫水以石蠟包埋，連續(xù)切片(5 μm)，以蘇木精-伊紅染色。用顯微鏡觀察腸道黏膜結(jié)構(gòu)，并以MoticMed 6.0圖像軟件分析。每張切片測(cè)定10根完整絨毛的絨毛高度和隱窩深度，選擇5張切片計(jì)算每個(gè)組織的平均值，具體方法參見(jiàn)Kim等的方法[6]。

1.5.5 糞便中乳酸菌、大腸桿菌、沙門氏菌數(shù)量 在無(wú)菌條件下，取1 g糞便到滅菌離心管中，加入等量的生理鹽水，混勻后梯度稀釋，取100 μL稀釋液涂板，置于37 ℃條件下，乳酸菌培養(yǎng)48 h，大腸桿菌培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[7]，每組4個(gè)重復(fù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 2010初步處理后，利用SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，P值為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，第Ⅰ階段，飼喂乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)斷奶仔豬的平均日采食量和平均日增質(zhì)量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)；第Ⅱ階段，顯著提高了平均日采食量和平均日增質(zhì)量(P<0.05)。

2.2 乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬免疫器官的影響

由表3可知，乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬肝臟、腎臟和脾臟質(zhì)量和相應(yīng)器官系數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.3 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬胃腸道食糜pH值的影響

由表4可知，飼喂發(fā)酵飼料的仔豬胃、回腸、結(jié)腸食糜pH值顯著降低，與對(duì)照組相比，處理組分別降低19.17%、7.45%、4.48%，空腸和盲腸中食糜pH值有降低趨勢(shì)(P>0.05)。

2.4 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬回腸和結(jié)腸食糜揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量的影響

由表5可知，飼喂發(fā)酵飼料的仔豬結(jié)腸內(nèi)乙酸含量顯著升高，丙酸含量有升高趨勢(shì)，分別提高22.99%、22.28%，丁酸、異丁酸、異戊酸、戊酸以及總揮發(fā)酸含量有所提高，但差異不顯著；在回腸中，飼喂乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬各VFA含量以及總VFA含量均未產(chǎn)生顯著影響。

表2 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響

表3 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬免疫器官指數(shù)的影響

表4 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬胃腸道食糜pH值的影響

2.5 乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬小腸絨毛形態(tài)的影響

由表6可知，發(fā)酵飼料對(duì)仔豬空腸和回腸絨毛高度、隱窩深度及二者之比值無(wú)顯著影響。

2.6 乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)仔豬糞便微生物的影響

由表7可知，與對(duì)照組比較，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高仔豬糞便中的乳酸菌數(shù)量，顯著降低大腸桿菌數(shù)量，有降低沙門氏菌數(shù)量的趨勢(shì)，但差異不顯著。

表5 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬回腸和結(jié)腸食糜VFA含量的影響

表6 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬空腸和回腸絨毛形態(tài)的影響

表7 發(fā)酵飼料對(duì)仔豬糞便微生物的影響 lg(CFU/g)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵飼料呈濃郁酸香氣味，同時(shí)飼料松軟、適口性好，這可能是導(dǎo)致仔豬采食量提高的主要原因，該結(jié)果也與Choi等的研究報(bào)道[8]一致。Shim等發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組和液態(tài)發(fā)酵組，固態(tài)發(fā)酵組肉雞平均采食量顯著提高[9]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于發(fā)酵飼料對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響爭(zhēng)議較大。有研究報(bào)道，添加乳酸菌發(fā)酵飼料有降低斷奶仔豬平均日增質(zhì)量和料重比的趨勢(shì)[10]。造成這一現(xiàn)象的原因很多，發(fā)酵所采用的菌種、發(fā)酵條件以及貯存環(huán)境的差異都可能影響最終結(jié)果。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，仔豬在斷奶后1～14 d的平均日增質(zhì)量略有降低，其原因可能是由于本試驗(yàn)采用了較極端的無(wú)抗飼料，在該期間，斷奶應(yīng)激導(dǎo)致了部分仔豬出現(xiàn)腹瀉，因此影響了仔豬生長(zhǎng)速度。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，在飼喂乳酸菌發(fā)酵飼料14 d后，飼喂發(fā)酵飼料仔豬平均日增質(zhì)量顯著提高，該結(jié)果說(shuō)明發(fā)酵飼料具有促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)的作用。

動(dòng)物胃腸道的酸度是影響其消化性能的重要因素，適宜的酸度是仔豬實(shí)現(xiàn)正常消化功能的關(guān)鍵，發(fā)酵飼料中的乳酸菌及產(chǎn)生的酸性物質(zhì)可降低動(dòng)物的胃腸道pH值[11]。在本試驗(yàn)中，飼喂發(fā)酵飼料顯著降低仔豬胃、回腸、結(jié)腸pH值。原因可能有2點(diǎn)：一是發(fā)酵飼料中的乳酸、乙酸等酸性物質(zhì)進(jìn)入腸道改變胃腸道pH值；二是可能發(fā)酵飼料中的乳酸菌定殖在腸道內(nèi)，乳酸菌大量生長(zhǎng)產(chǎn)生了大量乳酸，降低了仔豬腸道pH值。單胃動(dòng)物微生物發(fā)酵主要發(fā)生在消化道后端(結(jié)腸、盲腸、直腸)，一般以盲腸中VFA(主要有乙酸、丙酸、丁酸等)含量最高，VFA的存在對(duì)仔豬的后腸健康起到重要作用。Giang等發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加益生菌制劑，顯著提高了回腸和結(jié)腸中乙酸和丙酸含量[12]。本試驗(yàn)中，飼喂發(fā)酵飼料顯著提高仔豬結(jié)腸中乙酸含量，同時(shí)丙酸、總VFA含量均有升高趨勢(shì)，這可能是由于在結(jié)腸中定殖的乳酸菌大量繁殖并利用了碳水化合物發(fā)酵；而回腸中的各VFA以及總VFA含量與對(duì)照組間差異均不顯著，可能是小腸中的微生物數(shù)量相對(duì)較少，因此對(duì)腸道發(fā)酵的影響程度較低。

腸絨毛是小腸黏膜表面的上皮和固有層向腸腔內(nèi)的細(xì)小突起，小腸絨毛是小腸的基本功能單位，在消化道前段(十二指腸和空腸)分布最密，往后則逐漸減少。腸絨毛之間具有隱窩，隱窩深度決定腸絨毛通過(guò)有絲分裂產(chǎn)生上皮細(xì)胞的速度，反映了細(xì)胞生成率。隱窩變淺，表明細(xì)胞的成熟率上升，分泌功能強(qiáng)。Hampson指出，未斷奶前隨著日齡增加仔豬小腸絨毛高度增加，隱窩變深[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，從液體奶向固體飼料的過(guò)渡狀態(tài)會(huì)造成絨毛高度縮短，隱窩加深，這暗示斷奶會(huì)降低仔豬的消化能力，對(duì)仔豬的腸道形態(tài)有重要影響[14]。Choi等研究報(bào)道，飼喂液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵飼料的仔豬與對(duì)照組相比，空腸和回腸的絨毛高度和隱窩深度差異均不顯著，但二者之比差異顯著[8]。在本試驗(yàn)中，空腸絨毛高度和隱窩深度以及二者之比均無(wú)顯著差異，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，乳酸菌發(fā)酵飼料對(duì)斷奶仔豬的腸道發(fā)育無(wú)明顯影響。

本試驗(yàn)中，飼喂乳酸菌發(fā)酵飼料顯著降低了仔豬糞便中大腸桿菌數(shù)量，提高了乳酸菌數(shù)量，這與Konstantionov等的研究結(jié)果[15]一致，其原因可能是發(fā)酵飼料中的乳酸菌在腸道中大量定殖，競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪腸壁的定殖位點(diǎn)，同時(shí)乳酸菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分泌了有機(jī)酸(乳酸、乙酸等)以及某些抑菌因子，進(jìn)而抑制了大腸桿菌等有害菌在腸道內(nèi)的定殖，平衡了仔豬消化道微生物區(qū)系，進(jìn)而保障了仔豬的消化道健康。飼喂發(fā)酵飼料有降低沙門氏菌的趨勢(shì)，有研究表明，發(fā)酵飼料發(fā)酵產(chǎn)生的大量乳酸和乙酸等有機(jī)酸[16]，同時(shí)結(jié)合較低的pH值可以降低沙門氏菌的數(shù)量，但活性乳酸菌對(duì)沙門氏菌并無(wú)顯著抑制作用[17]。

乳酸菌發(fā)酵飼料可顯著提高仔豬平均日采食量，但對(duì)料肉比及平均日增質(zhì)量無(wú)顯著影響；乳酸菌發(fā)酵飼料可提高仔豬腸道內(nèi)VFA含量以及糞便乳酸菌數(shù)量，對(duì)仔豬腸道健康有改善作用。