谷 青， 趙冬梅， 張 岱， 何佳昱， 楊志輝， 朱杰華

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河北保定 071000)

隨著馬鈴薯成為繼水稻、小麥和玉米之后的世界第四大糧食作物，中國以占全球總種植面積的26.3%和全球總產(chǎn)量的22.2%成為全球最大的馬鈴薯生產(chǎn)國[1]。但是，由茄鏈格孢(Alternariasolani)引起的馬鈴薯早疫病一般可對(duì)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)造成20%～25%的損失，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)70%～80%[2]。馬鈴薯早疫病是一種氣傳多循環(huán)流行性病害，其病菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)。近年來，馬鈴薯早疫病在我國大多數(shù)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)頻繁發(fā)生和流行，嚴(yán)重影響著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。病原菌的遺傳變異和病菌的生存能力與對(duì)植物的致病能力有關(guān)，從而會(huì)影響病害的發(fā)生與流行，進(jìn)而對(duì)病害防控產(chǎn)生重要影響[4]，因此，了解一個(gè)區(qū)域病原菌的群體結(jié)構(gòu)對(duì)于可持續(xù)防控病害有極為重要的理論基礎(chǔ)作用[5]。

目前，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)、簡單序列重復(fù)區(qū)間(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)和簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)分子標(biāo)記技術(shù)已被應(yīng)用于茄鏈格孢以及其相關(guān)種類的遺傳多樣性研究。Sharma等利用RAPD標(biāo)記分析了蕓薹生鏈格孢(A.brassicicola)、蕓薹鏈格孢(A.brassicae)和蘿卜鏈格孢(A.raphani)等3種鏈格孢屬真菌，發(fā)現(xiàn)其基因型分化和地理來源之間存在明顯的相關(guān)性[6]。張福光利用AFLP分子標(biāo)記分析河北馬鈴薯早疫病病菌的群體遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，供試群體的遺傳多樣性較高，且AFLP分支與地理來源和病原菌產(chǎn)孢量有一定相關(guān)性[7]。SSR是由1～6個(gè)核苷酸組成的基本單元重復(fù)多次構(gòu)成的，在大多數(shù)真核生物基因組中豐富且具有高度多態(tài)性[8]。此外，SSR技術(shù)可靠，需要樣品量少，且簡單易操作，可產(chǎn)生共顯性和物種特異性遺傳標(biāo)記，因而在群體結(jié)構(gòu)研究中十分有利[9-10]。Meng等利用基因組文庫開發(fā)了7對(duì)SSR分子標(biāo)記，對(duì)中國的黑龍江省、河南省、云南省和福建省茄鏈格孢菌群體進(jìn)行遺傳研究，種群遺傳分析表明，病菌遺傳變異率很高，且菌群間無明顯地理隔離，推測這可能是隱藏的有性生殖和人類介導(dǎo)的基因流動(dòng)共同作用的結(jié)果[11]。

為明確北方一作區(qū)馬鈴薯早疫病病菌的遺傳結(jié)構(gòu)，研究其基因型與地理來源之間的關(guān)系，本研究利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室基于全基因組序列開發(fā)出的5對(duì)具有多態(tài)性的茄鏈格孢基因組微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對(duì)采自河北、黑龍江、內(nèi)蒙古、遼寧和寧夏5省(自治區(qū))的馬鈴薯早疫病病菌菌株進(jìn)行分析，也為探討北方一作區(qū)馬鈴薯早疫病病菌近年來發(fā)生流行規(guī)律的變化及防治提供參考。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2016年8—9月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院馬鈴薯病害研究中心完成。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室于田間采集典型發(fā)病葉片，取病健交界處后經(jīng)組織分離所得。采集自河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古和寧夏5省(自治區(qū))的菌種共74株，詳細(xì)信息見表1。

1.1.2 供試SSR引物 本試驗(yàn)采用筆者所在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的5對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物，分別是As-11933、As-36238、As-33836、As-43626、As-97240。5對(duì)引物通過超純聚丙烯酰胺凝膠電泳(ultra polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱ULTRAPAGE)純化方法，正向引物5′端修飾Fam、Hem、Tamrad 3種熒光基團(tuán)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳細(xì)信息見表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和反應(yīng)體系的構(gòu)建 馬鈴薯早疫病病菌DNA采用張福光等改良的CTAB法[12]提取。以ddH2O為陰性對(duì)照，擴(kuò)增反應(yīng)總體系為15 μL：7.5 μL 2×TaqPCR Master Mix，各0.15 μL 10 μmol/L引物，0.5 μL模板DNA，6.7 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 40 s；72 ℃ 15 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取2 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%[1×TAE緩沖液，TAE由三羥甲基氨基甲烷(tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)組成]瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照，將剩余PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司檢測。

表1 供試菌株信息

1.2.2 SSR數(shù)據(jù)分析 根據(jù)生工生物工程(上海)股份有限公司返回的SSR標(biāo)記測序峰圖，記錄多態(tài)性位點(diǎn)，有峰標(biāo)記的記為“1”，無峰標(biāo)記的記為“0”，在Excel中建立“0，1”矩陣。采用POPGENE Version 1.31軟件[13]對(duì)5省(自治區(qū))早疫病病菌菌株的等位基因頻率、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)、群體間的遺傳距離和遺傳一致度進(jìn)行分析。

1.2.3 馬鈴薯早疫病病菌聚類分析 通過MEGA 6.06軟件[14]打開POPGENE Version 1.32[13]生成的dgram.plt聚類圖文件，對(duì)5省(自治區(qū))群體間親緣關(guān)系進(jìn)行編輯修飾，通過NTSYS pc 2.1[15]的SAHN鄰接法進(jìn)行非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯早疫病病菌SSR基因座等位基因頻率分析

本研究利用5對(duì)SSR引物對(duì)74株早疫病病菌株(表1)的基因組DNA對(duì)應(yīng)的基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共檢測出26個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物檢出5.2個(gè)等位基因。在供試的74個(gè)早疫病病菌菌株中，基因座As-11933被檢測出的等位基因數(shù)最多，為7個(gè)，而基因座As-43626被檢測出的等位基因數(shù)最少，僅有3個(gè)(表3)。

等位基因頻率越高，代表該等位基因是當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢基因型(表3)。在26個(gè)等位基因中，有6個(gè)為單個(gè)群體所特有的，占全部等位基因的23.08%，10個(gè)為5個(gè)群體所共有的，占全部等位基因的38.46%。其中河北群體特有的等位基因有2個(gè)，分別位于As-11933、As-33836基因座中，遼寧群體特有的2個(gè)等位基因分別出現(xiàn)在As-33836、As-97240基因座中，內(nèi)蒙古群體和寧夏群體各自特有的1個(gè)等位基因均出現(xiàn)在As-36238基因座中，黑龍江群體無特有等位基因(表3)。占群體全部等位基因38.46%的共有等位基因頻率較高，70%在0.500 0以上，推測這是北方一作區(qū)馬鈴薯早疫病病菌共有的基因，而占全部等位基因23.08%的特有等位基因可能是新變異形成的基因，將來可能會(huì)對(duì)該地區(qū)馬鈴薯早疫病流行造成影響。

表3 5個(gè)微衛(wèi)星基因座的等位基因頻率及分布

注：標(biāo)有“a”“b”“c”“d”的分別代表河北、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏群體特有的等位基因。“*”代表河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、寧夏群體共有的等位基因。等位基因?qū)?yīng)數(shù)字表示不同片段的峰值編號(hào)。

2.2 馬鈴薯早疫病病菌不同區(qū)域間遺傳多樣性分析

由表4可知，5個(gè)早疫病病菌菌株群體的多態(tài)性基因位點(diǎn)數(shù)范圍為14～19個(gè)，平均為17.2個(gè)；多態(tài)性基因位點(diǎn)比例范圍為53.85%～73.08%，平均為66.16%；有效等位基因數(shù)(Ne)在1.254 8～1.400 4個(gè)之間，平均為1.319 3個(gè)；Shannon’s信息指數(shù)在0.247 4～0.368 5之間，平均為 0.306 6；Nei’s基因多樣性指數(shù)在0.158 6～0.242 2之間，平均為0.197 5。河北和遼寧群體的Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)相近，黑龍江和內(nèi)蒙古群體的Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)相近，而寧夏群體的這2個(gè)指數(shù)與上述4個(gè)群體相差較大。其中，尤以河北群體的Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)最高，寧夏群體的Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s基因多樣性指數(shù)最低，說明河北早疫病病菌菌株的遺傳多樣性最高，寧夏群體的遺傳多樣性最低。

表4 5省(自治區(qū))馬鈴薯早疫病病菌群體的遺傳多樣性分析結(jié)果

2.3 馬鈴薯早疫病病菌不同區(qū)域間遺傳分化和親緣關(guān)系聚類分析

通過POPGENE[13]軟件對(duì)5個(gè)地區(qū)群體間的遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，其中遺傳相似度越接近1，表明2個(gè)群體越相似。由表5可見，各群體之間相似度都很高，處于0.900 6～0.988 9之間。其中黑龍江與內(nèi)蒙古馬鈴薯早疫病病菌群體間遺傳相似度最大，遺傳距離最小，分別為0.988 9、0.011 2，而寧夏與黑龍江群體間遺傳相似度最小，遺傳距離最大，分別為0.900 6、0.104 7。

表5 5省(自治區(qū))馬鈴薯早疫病病菌的遺傳相似度和遺傳距離

注：對(duì)角線上方數(shù)據(jù)為遺傳相似度，對(duì)角線下方數(shù)據(jù)為遺傳距離。

通過MEGA軟件[14]對(duì)5省(自治區(qū))群體遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類，圖1結(jié)果顯示，5省(自治區(qū))馬鈴薯早疫病病菌群體可以分為3類，其中黑龍江菌株和內(nèi)蒙古菌株聚為1個(gè)小分支，遼寧菌株與河北菌株聚為1個(gè)小分支，寧夏菌株單獨(dú)為1個(gè)分支。從地理位置上來看，黑龍江與內(nèi)蒙古菌株采集地點(diǎn)相鄰，屬于東北區(qū)域，遼寧與河北菌株采集地點(diǎn)相鄰，屬于華北區(qū)域，而寧夏屬于西北區(qū)域，距離東北、華北兩大地域較遠(yuǎn)，這顯示群體遺傳距離與地理距離相符合。

2.4 馬鈴薯早疫病病菌微衛(wèi)星聚類分析

用生物學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件NTSYSpc 2.1[15]進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，26個(gè)等位基因組合共檢測到45個(gè)基因型。其中河北檢測到13個(gè)基因型，內(nèi)蒙古和黑龍江分別檢測到12個(gè)基因型，

遼寧檢測到9個(gè)基因型，寧夏檢測到11個(gè)基因型。占整個(gè)群體82.2%的37個(gè)基因型僅被檢測到1次，占整個(gè)群體 17.8% 的8個(gè)基因型不止在1個(gè)區(qū)域被檢測到。被測群體中最豐富的基因型①被檢測到14次，占整個(gè)群體的 18.91%，分布于除寧夏外的其余4個(gè)區(qū)域，是北方一作區(qū)的優(yōu)勢基因型；其次，被檢測到5次的基因型②是黑龍江群體的優(yōu)勢基因型，被檢測到4次的基因型③是遼寧群體的優(yōu)勢基因型，分別被檢測到4、3次的基因型④⑤是寧夏的優(yōu)勢基因型。

由樹狀聚類圖發(fā)現(xiàn)，當(dāng)相似系數(shù)為0.73時(shí)，可劃分為2大類群，其中第2大類群菌株主要來自寧夏；當(dāng)相似系數(shù)為0.76時(shí)，第1大類群可分為2個(gè)亞類群，其中第2亞群菌株主要來自黑龍江、內(nèi)蒙古，第1亞群菌株遺傳多樣性豐富，包括河北、遼寧的絕大部分菌株，以及內(nèi)蒙古、黑龍江的大部分菌株，還有2株寧夏的菌株(圖2)。這些結(jié)果顯示，寧夏群體與另外4省(自治區(qū))群體的遺傳距離較大，與用MEGA軟件對(duì)5省(自治區(qū))群體遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析的結(jié)果相符。

3 討論與結(jié)論

在群體遺傳研究中，分子標(biāo)記應(yīng)該集可靠性、可重復(fù)性于一體[16-17]，其中，SSR分子標(biāo)記滿足以上要求，且樣品需要量少，簡單易操作，可產(chǎn)生共顯性和物種特異性遺傳標(biāo)記，因而在群體結(jié)構(gòu)研究中應(yīng)用廣泛[9-10]。

在物種群體遺傳結(jié)構(gòu)研究中，物種與其地理來源之間的關(guān)系一直倍受關(guān)注。Kakvan等研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬鏈格孢(Alternariaalternate)的基因型與其地理來源存在一定的相關(guān)性[18-19]。本研究利用SSR分子標(biāo)記對(duì)中國北方馬鈴薯一作區(qū)馬鈴薯早疫病病菌群體進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)5個(gè)群體間親緣關(guān)系與地理來源有一定的相關(guān)性，這與張福光等利用AFLP分子標(biāo)記的研究結(jié)果[12]相符。馬鈴薯早疫病病菌群體聚類顯示，寧夏菌株和其余4個(gè)區(qū)域菌株有差別，單獨(dú)成為1個(gè)分支，河北和遼寧群體、黑龍江和內(nèi)蒙古群體的相似度高，這與地理分布上河北與遼寧接壤，屬于華北區(qū)域，黑龍江與內(nèi)蒙古菌株采集地點(diǎn)接壤，屬于東北區(qū)域，寧夏屬于西北區(qū)域，距其余4省(自治區(qū))較遠(yuǎn)的特點(diǎn)相符合。東北、華北、西北三大區(qū)域的氣候條件不同，易造成馬鈴薯早疫病病菌發(fā)生、遺傳結(jié)構(gòu)不同，且由于馬鈴薯早疫病病菌分生孢子跨區(qū)域長距離傳播的能力比較低，因而易造成相鄰區(qū)域間基因型更為相似的現(xiàn)象。而河北、遼寧、黑龍江、內(nèi)蒙古群體的遺傳距離小，這可能是種薯調(diào)運(yùn)，隨種薯材料在不同生產(chǎn)區(qū)域間傳播，使其獲得廣泛的基因交流的結(jié)果。西北寧夏群體與東北、華北區(qū)域馬鈴薯早疫病病菌群體的遺傳距離相差較大，說明寧夏馬鈴薯早疫病病菌與其他4省(自治區(qū))早疫病病菌不同，今后可在防治和對(duì)藥劑的敏感性方面作進(jìn)一步研究。

遺傳變異是種群多樣性的重要因素，目前普遍認(rèn)為茄鏈格孢菌是通過無性生殖繁殖的[20]，但是無性生殖中由基因突變、染色體變異引起的遺傳變異概率是非常低的，而本研究發(fā)現(xiàn)，占整個(gè)群體82.2%的37個(gè)基因型僅被檢測到1次，說明群體遺傳多樣性高，因此筆者推測，茄鏈格孢菌不止無性生殖。且在一些試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)了茄鏈格孢菌菌絲融合、異核體形成，以及細(xì)胞核融合的現(xiàn)象，這提示茄鏈格孢菌可能存在準(zhǔn)性生殖現(xiàn)象。