姜志艷， 楊慧楠， 邵學(xué)勤

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014010)

蒙古黃芪[Astragalimembranaceus(Fisch.) Bge. var.Mongholicus(Bge.) Hsiao ]為豆科黃芪屬，是內(nèi)蒙古特色藥用植物，具有很好的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于目前黃芪野生資源稀缺，大多進(jìn)行人工栽培[1]。近些年來，對(duì)藥用植物黃芪的研究主要集中在其藥理活性成分分析、有效成分提取等[2]，而有關(guān)黃芪的利用分子標(biāo)記輔助育種、數(shù)量性狀基因座(quantitative trait locus，簡稱QTL)定位、構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜和進(jìn)行黃芪種質(zhì)遺傳多樣性研究的相關(guān)信息較少。

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP)具有多態(tài)性高、DNA用量少、無需預(yù)知基因組序列信息、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，該分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳育種、種質(zhì)資源研究[3]、遺傳多樣性分析[4-6]、構(gòu)建遺傳圖譜(尤其是高密度分子圖譜)[7]及基因定位[8]等方面。目前，已有研究者利用簡單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat，簡稱SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplified polymorphic DNA，簡稱RAPD)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，簡稱SRAP)等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃芪進(jìn)行了遺傳多樣性研究，王敖利用SSR分子標(biāo)記對(duì)蒙古黃芪進(jìn)行了遺傳多樣性研究[9]，錢丹等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)分析了蒙古黃芪的親緣關(guān)系[10]。但目前尚少見有關(guān)藥用植物黃芪AFLP分子標(biāo)記分析及反應(yīng)體系相關(guān)研究的報(bào)道。為此，本研究以蒙古黃芪為試驗(yàn)材料，對(duì)AFLP分析過程中的影響因子進(jìn)行研究，建立優(yōu)化黃芪AFLP分析體系。以期為從分子水平上對(duì)黃芪進(jìn)行遺傳多樣性研究、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為蒙古黃芪，黃芪幼葉于2017年7月采集于包頭醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古特色藥用植物繁育種植基地。-80 ℃保存?zhèn)溆茫S芪組培苗于室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 對(duì)黃芪單株葉片進(jìn)行DNA的提取，黃芪基因組DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的純度和完整性，用紫外可見分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度，保存于-20 ℃冰箱。

1.2.2 基因組DNA的酶切-連接 使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ與MseⅠ(購自NEB)對(duì)黃芪基因組DNA進(jìn)行雙酶切，同時(shí)加入EcoRⅠ/MseⅠ接頭，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接作為預(yù)擴(kuò)增模板，酶切-連接一步完成。反應(yīng)總體積為 20.0 μL，含樣品DNA 2 μL(50 ng/μL)，EcoRⅠ 0.2 μL (15 U/μL)，MseⅠ0.3 μL(10 U/μL)，BSA 0.3 μL(10 mg/mL)，EcoRⅠ/MseⅠ(5 μmol/μL)接頭各0.4 μL，10×NEB reaction buffer 2.0 μL，10 mmol/L ATP 0.4 μL，T4連接酶(350 U/μL)0.8 μL，加ddH2O補(bǔ)足總體積至20.0 μL。分別設(shè)定酶切-連接時(shí)間為12、14、16 h，37 ℃溫浴。取出后保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 AFLP模板DNA的預(yù)擴(kuò)增 反應(yīng)總體系為20.0 μL，包括酶切-連接產(chǎn)物4.0 μL，10×PCR-buffer 2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)1.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，dNTPs(2 mmol/L)1.8 μL，引物E00(5′-GACTGCGTACCAAT TCA-3′)、M00(5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′)(各 50 μmol/L)，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20.0 μL，離心混勻進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。

1.2.4 AFLP模板DNA的選擇性擴(kuò)增 選擇性擴(kuò)增反應(yīng)采用表1中E3/M3引物組合將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物分別稀釋10、20、30、40倍進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。反應(yīng)總體系20.0 μL，包括稀釋預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物2.5 μL，10× buffer(含Mg2+)1.5 μL，dNTPs(2 mmol/L)2.0 μL，Taq酶(5 U/μL)0.15 μL，選擇性引物(50 ng/μL) 各1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足總體積至20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，13個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的退火溫度下降0.7 ℃；然后 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，26個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)增加1 s，最后 72 ℃ 10 min。

表1 篩選AFLP分子標(biāo)記的引物序列

1.2.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染 在PCR產(chǎn)物中加入1/3體積的變性劑，95 ℃變性5 min，于6%變性聚丙烯酰胺凝膠中，恒定功率70 W，預(yù)電泳30 min，上樣量為6 μL，電泳2 h后，進(jìn)行顯色、掃描膠板。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪基因組DNA提取質(zhì)量的檢測

中藥植物高質(zhì)量基因組DNA的提取對(duì)其后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行發(fā)揮著極為重要的作用。植物基因組DNA的提取受植物的組織材料、部位、形態(tài)特征等影響，例如有的中藥植物中含有多糖、酚等次生代謝物會(huì)直接影響DNA提取的純度，所以需要根據(jù)試驗(yàn)材料的實(shí)際情況，科學(xué)、合理地采用DNA提取方法。本研究采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[5]，從含多糖、酚的蒙古黃芪中簡便、快速地提取DNA，為分子遺傳標(biāo)記應(yīng)用于黃芪的種質(zhì)資源研究提供基礎(chǔ)[2]。

由圖1可見，提取的黃芪基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮，無脫尾彌散現(xiàn)象，無RNA條帶，提取的基因組比較完整，用紫外可見分光光度計(jì)檢測D260 nm/D280 nm值都在1.8～2.0，可用于黃芪AFLP分析。

2.2 酶切、連接體系的優(yōu)化

本研究對(duì)黃芪基因組進(jìn)行酶切連接采用了多種試驗(yàn)方法，關(guān)于限制性核酸內(nèi)切酶組合EcoRⅠ/MseⅠ、PstⅠ/MseⅠ的選擇與酶切、酶連分步法和一步法均有報(bào)道[11]。經(jīng)多次試驗(yàn)比較，最終確立本試驗(yàn)中AFLP體系的建立采用EcoRⅠ/MseⅠ雙酶切，酶切-連接一步完成，試驗(yàn)對(duì)酶切連接時(shí)間作了不同設(shè)置，處理時(shí)間為12、14、16 h(圖2)。得出最佳的酶切-連接時(shí)間為16 h。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切-連接時(shí)間為16 h的產(chǎn)物在100～1 500 bp范圍內(nèi)出現(xiàn)均勻、清晰的彌散帶，證明酶切徹底，可以為AFLP研究提供理想的模板，試驗(yàn)時(shí)間得到了縮減，試驗(yàn)效率得到了提高。

2.3 預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)

預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)是以酶切-連接產(chǎn)物作為模板，用引物 E0/P0 進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，在進(jìn)行選擇性擴(kuò)增之前，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物需要進(jìn)行一定量的稀釋，本研究中將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)分別設(shè)為5、10、15、20、25、30、40倍，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，不同稀釋倍數(shù)的模板即模板濃度對(duì)擴(kuò)增效果并無明顯影響(圖3)，經(jīng)過后續(xù)選擇性擴(kuò)增試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，為保證選擴(kuò)產(chǎn)物量的充分，最終確定將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋20倍。

2.4 AFLP引物的設(shè)計(jì)與篩選

根據(jù)接頭序列互補(bǔ)原則設(shè)計(jì)選擇性擴(kuò)增引物，選擇性擴(kuò)增引物是在預(yù)擴(kuò)增引物3′端隨機(jī)增加2個(gè)或3個(gè)選擇性堿基來進(jìn)行設(shè)計(jì)的，在AFLP分子標(biāo)記中的引物是隨機(jī)組合的，不同的引物組合成不同的引物對(duì)，用于選擇性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中黃芪AFLP分析所用36對(duì)引物分別采用E/M引物“2+2”“2+3”“3+3”(數(shù)字2、3表示引物最后的堿基數(shù))組合進(jìn)行篩選得到。其中5對(duì)引物組合(E-AG/M-CGT、E-AT/M-CTG、E-GA/M-CAA、E-TC/M-CAA、E-GT/M-CTG)表現(xiàn)出多態(tài)性，多態(tài)性比率80.5%，詳見圖4、圖5。

2.5 銀染體系的優(yōu)化

AFLP分子標(biāo)記中需要進(jìn)行大量的凝膠電泳試驗(yàn)，凝膠電泳后膠板的顯色費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，同時(shí)還會(huì)受到諸多因素的影響，如電泳電壓的高低、顯影液的溫度、銀染的時(shí)間、配制膠板的質(zhì)量、試劑尿素質(zhì)量的好壞等，都會(huì)對(duì)銀染結(jié)果產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)參考多種銀染方法，進(jìn)行多次嘗試與改進(jìn)，最終得到優(yōu)化的銀染方法，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、恒定功率為70 W，預(yù)電泳時(shí)間為30 min，預(yù)電泳時(shí)間不易過短，電泳時(shí)間為120 min。具體步驟如下：(1)固定。將玻璃板從電泳槽中取出，拔出梳子，輕輕將長板取下，放入2 L蒸餾水+20 mL冰乙酸+200 mL無水乙醇溶液中，輕輕搖動(dòng)15～20 min。(2)漂洗。在2 L蒸餾水中漂洗2次，每次2～3 min。(3)染色。在2 L蒸餾水中加入4 g硝酸銀，染色15 min。(4)顯影。在2 L蒸餾水中加入60 g氫氧化鈉、10 mL甲醛顯影至條帶清晰為止。(5)中止。當(dāng)條帶不再清晰時(shí)，將板取出放入最初配好的固定液中，中止2 min。(6)漂洗。在2 L蒸餾水中漂洗2 min，自然風(fēng)干，拍照。

3 討論

黃芪作為內(nèi)蒙古的特色藥用經(jīng)濟(jì)植物，被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥中，但目前野生黃芪資源稀缺，所以大多采用人工栽培的方法培育黃芪。近年來，國內(nèi)外對(duì)黃芪的研究除藥理活性成分、有效成分提取外，開始從DNA分子水平上研究蒙古黃芪的道地性等并取得了一些進(jìn)展，而對(duì)黃芪分子標(biāo)記輔助育種、QTL定位、構(gòu)建遺傳圖譜的研究則鮮有報(bào)道。本研究所探討的AFLP分子標(biāo)記在黃芪上的應(yīng)用，將會(huì)為蒙古黃芪遺傳多樣性研究、圖譜構(gòu)建等奠定基礎(chǔ)。

本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蒙古黃芪進(jìn)行分析，結(jié)果表明有一定的可行性，擴(kuò)增條帶多、重復(fù)性好，為降低試驗(yàn)成本、縮短試驗(yàn)周期、提高試驗(yàn)效率，在體系優(yōu)化過程中，采用EcoRⅠ/MseⅠ對(duì)黃芪基因組DNA進(jìn)行雙酶切，且酶切-連接采用一步法完成，AFLP分子標(biāo)記雖然操作復(fù)雜、對(duì)試驗(yàn)技術(shù)要求高，但目前仍是一種十分理想、有效的分子標(biāo)記方法[11]。

對(duì)于某一種具體的試驗(yàn)材料藥用植物黃芪來說，并不是所有引物對(duì)組合都是適宜的，所以大量的試驗(yàn)工作是必須篩選出適合某種具體藥用植物的引物對(duì)。在進(jìn)行大量的引物篩選過程中發(fā)現(xiàn)，不同引物對(duì)組合之間對(duì)于選擇性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果差異很大，有的引物對(duì)擴(kuò)增出的主帶多而清晰，差異條帶也多，而有的引物對(duì)擴(kuò)增出的條帶數(shù)較少，有的引物對(duì)擴(kuò)增出的差異條帶也很少等。本研究中應(yīng)用選出的擴(kuò)增條帶信號(hào)強(qiáng)、重復(fù)性好的5對(duì)引物組合對(duì)部分黃芪植株進(jìn)行了分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，AFLP是標(biāo)記效率最高的分子標(biāo)記之一，但其技術(shù)操作復(fù)雜，影響因素很多，尤其是對(duì)該植物基因組信息了解得不是很清楚的情況下，一般選用該植物的同科近緣植物的AFLP引物進(jìn)行篩選，是一種快速、有效的引物篩選方法。本試驗(yàn)中所篩選的引物來自黃芪同科不同屬植物大豆。