郭文婷， 張鵬飛， 李瀟玲， 張 析， 張 薇

(石河子大學農學院/新疆綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室，新疆石河子 832000)

枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.)是一種真菌性土傳病害，由尖孢鐮刀菌引起。枯萎病對棉花的生產發(fā)展造成了嚴重的損失。由于枯萎病病菌自身的一些傳播特點，傳統(tǒng)的防護措施及一些治病方法效果不是很理想，因此培育和種植抗枯萎病品種是一種有效的辦法。陸地棉種抗病基因資源較豐富，因此從陸地棉中分離抗枯萎病相關的基因，通過轉基因技術可為海島棉抗枯萎病育種奠定基礎。

當植物被病原菌侵染時會發(fā)生一系列的應激防衛(wèi)反應，其中一些植物的內源性激素發(fā)揮重要作用。另外，一些轉錄因子在植物抗病中扮演著重要角色，它們通過結合下游基因啟動子中順式元件，調節(jié)下游防衛(wèi)基因。AP2/ERFBP轉錄因子中的ERF亞家族主要參與了植物體的生物和非生物脅迫下的應答反應。ERF亞家族轉錄因子只含有1個保守的AP2/ERF結構域，一般由58～59個氨基酸殘基組成[1-2]。很多信號分子可以誘導ERF轉錄因子，當病原菌侵染棉花時，棉花自身會發(fā)生應激反應而產生許多小分子物質，如乙烯(ethyl ene，簡稱ET)、水楊酸(salicylicacid，簡稱SA)、茉莉酸(jasmonicacid，簡稱JA)等激素，這些激素發(fā)揮信號分子的作用[3]，此外大多數(shù)ERF轉錄因子在植物抗病過程中處于信號交叉途徑，發(fā)揮著連接因子的作用[4]。莫紀波等研究發(fā)現(xiàn)轉錄因子在不同的激素互作中發(fā)揮重要作用，進而激活了植物抗病信號途徑中的一些信號通路[4]。金莉研究發(fā)現(xiàn)，GbERF1轉錄因子基因通過增強抗病相關基因的表達，從而提高棉花的抗病能力[5]。劉坤等克隆了GbEREB5和GbEREB6這2個屬B3亞組的轉錄因子基因，研究發(fā)現(xiàn)可以提高NtCHI-B、NtPR2等PR蛋白基因的表達量[6]。在作物中過量表達ERF類轉錄因子基因，可以使下游的一些抗病基因和一些與抗病相關的基因呈上調表達，不僅提高了作物對某種單一病害的抗性，而且增加了作物對多種病害的抗病力[7]。轉錄因子在植物抗病中具有更高的應用價值。與轉入單一的抗病基因的轉基因方式相比，其能夠激活或抑制多個下游基因的表達，進而獲得抗病力更強的轉基因植株[8]。目前，雖然棉花中ERF轉錄因子數(shù)目較多，但是對它們功能的研究還不是很深入。在海島棉中，對抗枯萎病相關的ERF轉錄因子基因的研究有限，ERF轉錄因子與植物內源性激素之間的互作尚不明確。本研究用對枯萎病病菌有差異表達的ERF為探針，克隆了ERF-B3亞組的轉錄因子基因GhERF5-1，利用生物信息學分析GhERF5-1基因的結構、qRT-PCR技術分析GhERF5-1基因在枯萎病病菌處理下的表達模式，希望能夠為海島棉抗病提供新的基因資源和為作物抗病分子育種提供有用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為陸地棉品種中棉所12，由石河子大學農學院育種教研室保存；枯萎病病菌菌株為F430，由石河子大學農學院植物保護系張莉老師惠贈。將籽粒飽滿的種子用10%的過氧化氫溶液浸泡2～3 h后，用ddH2O沖洗6遍后種植于蛭石中。當棉苗長出第1張真葉時，轉移到霍格蘭培養(yǎng)液中于(24±3) ℃、光照16 h、黑暗8 h在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待棉苗長至2葉1心時，選取生長一致的棉苗，分別浸于濃度為1×107個/mL的枯萎病病菌孢子懸浮液、1 mmol/L乙烯、50 μmol/L 水楊酸和 1 mmol/L 茉莉酸甲酯的霍格蘭營養(yǎng)液中40 min，然后轉入霍格蘭營養(yǎng)液中。以相同生長條件下用水處理的棉苗作為平行對照Mock，分別在0、1、2、3、6、12、24、48 h時間點取處理棉苗和對照的根部組織，液氮冷激后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 基因全長cDNA的克隆 利用筆者所在實驗室得到的棉花抗枯萎病表達譜中的ERF序列為探針，在NCBI網(wǎng)站用tBlastn方式比對搜索，下載同源性高的ESTs序列；利用CAP3拼接軟件進行ESTs的拼接，將拼接完整的序列進行分析，找到其ORF后利用NCBI尋找其保守域；利用MEGA 5.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹分析所得電子序列與已知ERFB3亞組基因的親緣關系。使用Oligo 7設計全長引物(上游引物F1：GGGGTACCATGGAAAGTAGCAGTGAAGTGTC；下游引物R1：CGGGATCCGATGACCGTAACTTGTTGAAAGC)。棉花總RNA的提取采用CTAB法，通過反轉錄得到cDNA后進行PCR擴增，得到預期大小的基因片段，連接pMD19-T載體后，利用熱激法將質粒轉入大腸桿菌，篩選陽性克隆進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫和Cottongen數(shù)據(jù)庫的基礎上，利用生物信息學軟件分析GhERF5-1基因的開放讀碼框、編碼蛋白的理化性質、蛋白親疏水性、蛋白高級結構等，多序列比對用DNAMAN軟件，用MEGA 5.0軟件做進化樹分析。表1為所用的生物信息學分析軟件。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析 根據(jù)目的基因的cDNA序列設計qRT-PCR上游引物Fq：CCTAAGCCCTTTGAATTTAC-ACCT和下游引物Rq：CCACTCTACTTTATGCGGTAACGA；以棉花的持家基因GhUBQ7作為內參基因，上游引物Fu：GAAGACCTACACCAAGCCCAAG；下游引物Ru：CGGACTCTA-CTCAATCCCCACC。試驗共設3個重復，最后采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。

表1 生物信息學分析軟件及在線分析工具

2 結果與分析

2.1 基因全長cDNA的克隆

以筆者所在實驗室前期獲得的枯萎病病菌誘導棉花根部基因表達譜中有明顯差異表達的ERF數(shù)據(jù)為基礎，利用電子拼接方法得到1條長度為990 bp的序列。用ORF Finder在線軟件分析得出，該基因開放閱讀框(ORF)為990 bp，根據(jù)該ORF序列設計全長引物，以前期獲得的中棉所12的棉花根部cDNA為模板，擴增出1條長度約1 000 bp的片段(圖1)，篩選陽性克隆進行測序，結果表明，該基因全長為990 bp，與電子克隆序列一致，通過和擬南芥ERFB3亞組基因進行系統(tǒng)進化樹分析，結果發(fā)現(xiàn)，該基因在進化上與擬南芥B3亞組的AtERF5親緣關系最近，所以將該基因命名為GhERF5-1(GenBank登錄號：MF145657)。

2.2 生物信息學分析

2.2.1 多序列比對及同源進化分析 從NCBI下載10個已知擬南芥ERF-B3亞組的基因進行多序列比對分析，結果發(fā)現(xiàn)，GhERF5-1基因編碼氨基酸序列在180～244之間，含有構成了ERF亞族轉錄因子典型的AP2結構域(圖2)。為了進一步分析GhERF5-1基因與ERF亞族其他轉錄因子之間的進化關系，利用MEGA 5.0軟件，將該基因編碼的氨基酸與擬南芥的ERF-B3亞組氨基酸序列作同源進化樹分析，結果(圖3)表明，GhERF5-1基因編碼的蛋白與擬南芥AtERF5同處于1個分支，說明該基因在進化上與擬南芥ERF-B3亞組的基因AtERF5親緣關系最近，進一步說明GhERF5-1基因屬于ERF-B3亞組。

2.2.2 基因編碼蛋白的一級結構分析 對該基因編碼蛋白的理化性質進行分析可知，該基因編碼329個氨基酸，蛋白分子量為36.52 ku，分子式為C1 614H2 488N450O510S5，理論等電點為6.15。在組成這個蛋白的所有氨基酸中，所占比例最高的為絲氨酸(Ser)，達到12.5%。甲硫氨酸(Met)含量最低，為0.6%。蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為47.36，脂肪指數(shù)為61.12，總平均親水性為-0.701，預測該蛋白為1個親水的不穩(wěn)定蛋白。

2.2.3 基因編碼蛋白磷酸化分析和親疏水性分析 磷酸化和去磷酸化是蛋白質翻譯后修飾中的重要形式之一[9]?；虻慕Y構決定其功能，蛋白質磷酸化在蛋白結構功能的研究中具有重要的意義。利用NetPhos 3.1 serve(http：//www.cbs.dtu.dk/services/DetPhos/)預測該基因編碼蛋白的磷酸化位點(圖4)，結果顯示，該蛋白總共含有29個絲氨酸、11個蘇氨酸和1個酪氨酸磷酸化位點。因此推測在棉花上，GhERF5-1基因有可能被酪氨酸激酶、絲氨酸激酶、蘇氨酸激酶磷酸化修飾后激活調控基因的表達，進而調控蛋白的活性。對GhERF5-1基因編碼的蛋白進行親/疏水性分析，結果見圖5。在多肽鏈中，第258位的氨基酸親水性最強，分值為 -3.3；第310位的氨基酸疏水性分值最高，為1.2。說明該蛋白是1個親水蛋白，進一步說明該蛋白是1個不穩(wěn)定蛋白。

2.2.4 蛋白高級結構預測 對該基因編碼的蛋白進行二級結構分析，結果見圖6。分析表明，該蛋白二級結構的主要組成元件是α螺旋與無規(guī)則卷曲，β折疊只占15.81%。由圖6可知，GhERF5-1基因編碼的蛋白質二級結構中最主要的結構原件是以無規(guī)則卷曲的形式存在，α螺旋分散在整個蛋白中。蛋白的結構功能域分析結果(圖7)顯示，該蛋白在 180～244之間是個高度保守的AP2結構功能域，該結構域是ERF亞家族共有的典型結構域。AP2結構保守域的C端序列是由18個氨基酸殘基組成的核心序列，形成雙親性的α螺旋參與了同DNA元件或其他轉錄因子間的相互作用，N端的堿性親水區(qū)是由3個反向平行的β-折疊構成[10]。三級結構的同源建模分析，預測GhERF5-1轉錄因子基因的立體結構，結果(圖8)表明，GhERF5-1轉錄因子的ERF結構域與擬南芥的AtERF5的非常相似，由此推測GhERF5-1所編碼的蛋白可能有與AtERF5有相同的特性，可以與下游基因啟動子中GCC-box結合，從而實現(xiàn)對下游抗病基因的激活。

2.3 實時熒光定量PCR分析

利用qRT-PCR分析枯萎病病菌處理后GhERF5-1基因的表達。結果(圖9)發(fā)現(xiàn)，枯萎病病菌處理抗病品種中棉所12號后，該基因的相對表達量均高于平行對照Mock，為上調表達。枯萎病病菌侵染后，隨著侵染時間的延長，GhERF5-1基因的表達趨勢是先增加后降低，在處理后2 h，該基因的相對表達量迅速增加，達到最大，是Mock的3倍，隨后表達量逐漸降低，48 h時，其相對表達量與對照Mock基本相同。由此可知，GhERF5-1基因對枯萎病有明顯的響應，推測該基因在棉花抗病中可能發(fā)揮一定的作用。

3 討論

ERF亞族作為植物特有的一類轉錄因子，在植物應激反應中發(fā)揮著很大作用。ERF-B3亞組轉錄因子通過與其下游PRs基因啟動子中的GCC-box順式作用元件結合，進一步調控PRs基因的表達，如AtERF1通過結合PR基因PDF1.2啟動子中的GCC-box， 從而激活其表達[11]。郭偉峰等從海島棉品種海7124中克隆了乙烯信號路徑的1個ERFs類轉錄因子基因GbERF1-like，研究發(fā)現(xiàn)其參與棉花的抗病反應，在棉花抗黃萎病中有重要的調節(jié)作用[12]。何蘭蘭等利用電子克隆技術克隆了ERF-B3亞組轉錄因子基因GhB301，發(fā)現(xiàn)其對枯萎病有一定的響應[13]。本試驗利用電子克隆及RT-PCR技術，從棉花抗枯萎病品種中棉所12的根部cDNA克隆得到1個ERF轉錄因子GhERF5-1，序列分析表明，該基因cDNA全長990 bp，編碼329個氨基酸，無內含子。系統(tǒng)進化樹分析表明，GhERF5-1屬于ERF-B3亞組的轉錄因子。對該基因編碼的蛋白序列進行同源比較及結構域分析，發(fā)現(xiàn)該基因在180～244之間有1個高度保守的AP2結構功能域。進一步對該基因進行表達分析，結果發(fā)現(xiàn)，枯萎病病菌誘導后，該基因對枯萎病有明顯的響應，本試驗結果與孟憲鵬對EREB1基因和EREB2在受到黃萎病菌的誘導后基因的表達分析結果[14]一致。

蛋白質翻譯后的修飾最常見的是糖基化、磷酸化、甲基化和ADP核糖基化，其中蛋白磷酸化是十分重要的蛋白翻譯后修飾[9]。它是通過蛋白質激酶的作用把磷酸基團轉移到絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的一系列反應[15]。植物通常通過蛋白之間的相互磷酸化或者自磷酸化來調整蛋白在體內的活性[16]。研究發(fā)現(xiàn)，ERF轉錄因子基因含相對保守的一些磷酸化位點[17]，進一步研究認為，ERF轉錄因子基因的磷酸化修飾可能與轉錄活性的調控或蛋白穩(wěn)定性有關[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，GhERF5-1基因編碼蛋白含有29個絲氨酸、11個蘇氨酸和1個酪氨酸磷酸化位點，推測該基因可能通過磷酸化反應參與一些激素的信號通路，進而響應脅迫。

目前在棉花中對抗病相關的ERF-B3亞組基因研究不是很多，本試驗克隆得到的基因初步分析對棉花枯萎病有一定的響應，但是該基因在抗病調控途徑中具體的調控機制還不是很清楚，有待進一步研究。

4 結論

生物信息學分析表明，該基因的cDNA全長為990 bp，總共編碼329個氨基酸，分子量36.52 ku，等電點為6.15，編碼的蛋白是1個親水的不穩(wěn)定蛋白。qRT-PCR分析結果表明，枯萎病病菌侵染后，隨著侵染時間的延長，GhERF5-1基因的表達趨勢是先增加后降低，在處理后的2 h基因的相對表達量是5.91，達到最大，是Mock的3倍。從3 h起，相對表達量逐漸降低，12 h的相對表達量最低，為0.19。