朱 萌 孫武剛

1.運(yùn)城護(hù)理職業(yè)學(xué)院病理學(xué)教研室，山西運(yùn)城 044000；2.山西省運(yùn)城市中心醫(yī)院病理科，山西運(yùn)城 044000

肝內(nèi)膽管癌屬于惡性腫瘤，患者的肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞先發(fā)生病變，逐步侵襲、轉(zhuǎn)移，給患者帶來(lái)巨大的痛苦，甚至威脅患者生命[1]。相關(guān)報(bào)道顯示，近年來(lái)肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)增長(zhǎng)形式，且死亡率也明顯升高[2-3]。有文獻(xiàn)指出，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是引發(fā)癌細(xì)胞向局部浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移的重要因素之一[4-5]。Snail基因的表達(dá)產(chǎn)物是一種在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過(guò)程中居于重要地位的轉(zhuǎn)錄因子。EMT是包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制[6-7]。本研究旨在探討Snail蛋白在肝內(nèi)膽管癌患者中的表達(dá)及其意義，為臨床診治肝內(nèi)膽管癌提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月～2016年2月在運(yùn)城市中心醫(yī)院就診的72例肝內(nèi)膽管癌患者，其中男37例，女35例；年齡≥65歲21例，年齡＜65歲51例；血清癌胚抗原（CEA）≥5 ng/ml 52例，＜5 ng/ml 20例； 腫瘤標(biāo)志物血清 CA19-9≥37 ng/ml 39 例，CA19-9＜37 ng/ml 33例；TNM分期≤Ⅱ期42例，Ⅲ或Ⅳ期30例。所有患者均符合以下標(biāo)準(zhǔn)：①均進(jìn)行相應(yīng)根治性切除手術(shù)；②手術(shù)前未接受放療、化療等治療；③無(wú)心、肺等重要器官性疾??；④患者及其家屬均同意參與研究，并簽署知情同意書(shū)。本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。對(duì)所有患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止到2017年6月，無(wú)一例患者失訪，平均隨訪時(shí)間為（18.21±13.11）個(gè)月。

1.2 檢測(cè)方法

先制作切片，將獲得的患者組織用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，脫去水分，石蠟包埋，組織切成薄片制片備用。將切片在90℃烘烤2 h。然后將其浸泡在二甲苯溶液中15 min，再重復(fù)進(jìn)行1次。之后按順序分別放入濃度為100%、95%、90%、75%、70%的乙醇溶液中浸泡5 min。在100℃下使用濃度為10 mmol/L的檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)，持續(xù)進(jìn)行10 min后，放置室溫下30 min使其溫度降低。向切片滴加3%過(guò)氧化氫保持20 min，阻止內(nèi)源性過(guò)氧化物酶發(fā)揮作用。每張切片滴加非免疫動(dòng)物血清（5%牛血清蛋白），封存2 h。向切片滴加1∶500的一抗兔抗Snail單克隆抗體，進(jìn)行孵育，4℃過(guò)夜。往切片滴入山羊抗兔二抗，進(jìn)行孵育20 min，DAB顯色，在顯微鏡觀察下加入蘇木精進(jìn)行復(fù)染，出現(xiàn)水化作用及透明變化，封固保存切片。使用顯微鏡進(jìn)行檢查，并將觀察到的數(shù)據(jù)記錄下來(lái)。

1.3 觀察指標(biāo)

①癌組織及癌旁組織Snail蛋白的表達(dá)情況：評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)與復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所制定標(biāo)準(zhǔn)[8]一致，由染色面積和強(qiáng)度兩項(xiàng)組成。當(dāng)染成棕色的面積超過(guò)一半時(shí)記1分，否則記0分；當(dāng)未被染色時(shí)記0分，染色較淺記1分，顏色呈棕黑時(shí)記2分。兩項(xiàng)得分相加，分?jǐn)?shù)≥2分為Snail蛋白高表達(dá)，分?jǐn)?shù)＜2分則是Snail蛋白低表達(dá)。高表達(dá)率=高表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。②臨床病理因素：包括性別、年齡、血清CEA、腫瘤標(biāo)志物血清CA19-9、TNM分期、微血管是否侵犯及有無(wú)復(fù)發(fā)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 .結(jié)果

2.1 患者癌組織及癌旁組織Snail蛋白表達(dá)情況的比較

癌組織的免疫組化評(píng)分明顯高于癌旁組織 （P＜0.05）；癌組織的Snail蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）（表 1）。

表1 患者癌組織及癌旁組織Snail蛋白表達(dá)情況的比較

2.2 Snail蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

不同表達(dá)的Snail蛋白之間的性別、年齡、血清CEA、腫瘤標(biāo)志物血清CA19-9比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；不同表達(dá)的Snail蛋之間的TNM分期、微血管是否侵犯及有無(wú)復(fù)發(fā)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 2）。

表2 Snail蛋白的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]

2.3 多因素分析患者總存活率及總復(fù)發(fā)率情況

多因素分析顯示，不同TNM分期的總存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表達(dá)或低表達(dá)的總存活率及總復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 3）。

表3 多因素分析患者總存活率及總復(fù)發(fā)率情況

3 討論

肝內(nèi)膽管惡性腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲能力，容易引起患者死亡，這給醫(yī)學(xué)工作者的治療工作帶來(lái)了挑戰(zhàn)，需要尋找準(zhǔn)確有效的因子對(duì)肝內(nèi)膽管癌的預(yù)后進(jìn)行分析。EMT是惡性腫瘤發(fā)展的重要機(jī)制，其在肝內(nèi)膽管癌這一惡性腫瘤的侵襲中也發(fā)揮了重要作用[9-10]。Snail蛋白是EMT發(fā)展中協(xié)助轉(zhuǎn)錄的重要蛋白因子，能夠抑制上皮細(xì)胞E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生EMT[11-12]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法，對(duì)肝內(nèi)膽管癌患者癌組織及癌旁組織標(biāo)本中Snail蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，旨在尋找肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后評(píng)價(jià)的有效標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，癌組織的免疫組化評(píng)分明顯高于癌旁組織（P＜0.05）；癌組織的Snail蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。可能原因是在腫瘤組織中，Snail蛋白的表達(dá)更多，進(jìn)一步提示Snail蛋白的表達(dá)與癌組織的轉(zhuǎn)移等有關(guān)[13-14]。Snail蛋白的表達(dá)與性別、年齡、癌胚抗原血清CEA、腫瘤標(biāo)志物血清CA19-9 之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）；Snail蛋白的表達(dá)與TNM分期、微血管是否侵犯及有無(wú)復(fù)發(fā)，存在明顯差異（P＜0.05），提示Snail蛋白的表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)，這與周博鑫等[15-16]的研究結(jié)果一致。其可能通過(guò)作用于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，使細(xì)胞表型等方面發(fā)生改變，促使其發(fā)生EMT，進(jìn)而導(dǎo)致肝內(nèi)膽管癌進(jìn)一步侵襲[17-18]，這也提示可以從轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白方面入手，尋找減弱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的方法，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲，從而減輕患者痛苦，為患者帶來(lái)希望[19]。

本研究結(jié)果還顯示，TNM分期對(duì)總存活率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；微血管是否侵犯及Snail蛋白的高表達(dá)或低表達(dá)的總存活率及總復(fù)發(fā)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)肝內(nèi)膽管癌患者進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，能夠?yàn)榕R床工作提供有效的依據(jù)，且對(duì)于減少患者術(shù)后復(fù)發(fā)情況的發(fā)生及提高患者存活率有著重要的意義[20]。

綜上所述，免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝內(nèi)膽管癌患者癌組織中Snail蛋白的表達(dá)要高于癌旁組織，并且Snail蛋白的表達(dá)與肝內(nèi)膽管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)，可以作為評(píng)價(jià)肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的指標(biāo)。