倪少俊 雷 悅 徐秋月 王 成 劉瓏玲

1.遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬（珠海）醫(yī)院燒傷整形手外科，廣東珠海 519100；2.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)免疫實驗室，廣東珠海 519090

燒傷患者由于皮膚的完整性受到破壞，其基本功能受到明顯損害而失去平衡，使得燒傷患者發(fā)生感染的概率有明顯且逐漸增加的趨勢[1]。在燒傷患者死亡危險因素中，感染是最主要危險因素之一[2]。研究顯示，T、B細胞的分化、發(fā)育都離不開Notch信號通路的參與[3-5]。燒傷患者機體存在細胞免疫功能低下的同時也會表現(xiàn)出對炎性反應(yīng)的增強[6-7]，這些病理變化是否有Notch信號通路的參與值得探討。本課題旨在通過研究Notch信號通路在燒傷感染患者外周血淋巴細胞（peripheral blood lymphocytes，PBL）中的表達，探討Notch信號通路與燒傷感染患者淋巴細胞的關(guān)系，闡明Notch信號在燒傷感染調(diào)節(jié)中的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院燒傷科2016年7月～2017年7月收治的15例燒傷感染患者作為燒傷感染組，采用中國新九分法估算患者燒傷面積，三度四分法估算患者燒傷深度，其中男8例，女7例；年齡為 21～46歲，平均（36.8±7.90）歲；21歲 2例,32 歲 3 例，37 歲 4 例，40歲1例，44歲2例，46歲3例。選取同期在我院進行健康體檢的15例健康者作為對照組，其中男9例，女6例；年齡為 19～52 歲，平均（36.27±10.64）歲；19 歲 1 例，23歲3例，34歲2例，36歲4例，44歲2例，52歲3例。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)，入選本研究的對象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

TRIZOL試劑購自美國Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自德國Qiagen公司，SYBRAdvantageqPCR Premix試劑盒購自日本Takara公司，兔抗人Notch 1和Notch 2抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)本收集及淋巴細胞分離 根據(jù)分組結(jié)果，分別采取燒傷感染組和健康對照組研究對象的靜脈血3～5 ml，肝素抗凝管收集血液樣本，人PBL分離液分選獲得PBL，操作步驟按試劑說明書進行。收集后的淋巴細胞分成兩部分，一部分用于提取總RNA，一部分用于提取總蛋白。

1.3.2 實時熒光定量 PCR（real-time PCR，RT-PCR）檢測Notch 1和Notch 2基因mRNA的表達 采用經(jīng)典的TRIZOL法提取樣本細胞的總RNA，取1 μl RNA樣品測定A260/A280比值，確保其濃度和純度符合要求后，其余放在-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。cDNA的合成嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。采用Takara公司SYBRAdvantageqPCR Premix試劑盒進行PCR反應(yīng)，總反應(yīng)體積為20 μl，每個樣本做3個重復(fù)，取平均值作為最終數(shù)值。Notch 1和Notch 2基因及內(nèi)參β-actin引物序列參照文獻[8]，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其具體序列見表1。RT-PCR結(jié)果采用 2-ΔΔCt方法運算。

表1 Notch1和Notch2基因及內(nèi)參引物序列

1.3.3 免疫印跡法（Western-blot）檢測Notch 1和Notch 2蛋白 裂解PBL提取蛋白，BCA法進行蛋白質(zhì)定量，根據(jù)蛋白濃度計算蛋白及上樣緩沖液的體積，總蛋白中加入5×Buffer蛋白上樣緩沖液，沸水浴15 min，每個泳道蛋白上樣20 μg，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后恒流濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h后，加入免抗人Notch 1和Notch 2抗體（稀釋比為1∶750）4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min。加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（稀釋比為 1∶1000），孵育 1 h，TBST 洗膜 3次，每次3 min。加入ECL化學(xué)發(fā)光液，成像儀上進行曝光，對圖像進行灰度分析。結(jié)果以目的蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值之比來表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用 t檢驗，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平的變化

RT-PCR結(jié)果顯示，燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA表達水平分別是健康人的6.73倍和2.56倍。與健康人相比，燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2基因mRNA水平均顯著性高于健康人群（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 熒光定量PCR檢測

2.2 燒傷感染患者PBL中Notch 1和Notch 2蛋白水平的變化

Western-blot檢測燒傷感染患者與健康人群PBL中Notch 1和Notch 2蛋白表達結(jié)果顯示，健康人與燒傷感染患者的PBL都有Notch 1和Notch 2蛋白表達，并且兩者在燒傷感染患者中的表達皆顯著高于對照組（P＜0.05）（圖 2）。

圖2 Western-blot檢測

3 討論

Notch信號通路是一個古老的信號傳導(dǎo)途徑，在各種低等級和高等級動物中都廣泛存在，并且在物種進化過程中保持高度保守性，Notch受體通過與鄰近細胞的配體相互作用來精確調(diào)節(jié)各譜系細胞和組織的分化，是一條影響細胞命運的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。完整的Notch信號通路組成包括Notch受體、Notch配體和細胞內(nèi)效應(yīng)分子DNA結(jié)合蛋白以及Notch的調(diào)節(jié)分子等[9]。國內(nèi)外的研究顯示，Notch信號在外周免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，對免疫細胞分化和調(diào)節(jié)過程的作用尤為顯著[10-11]。特異性抗原激活淋巴細胞后進行特異性的克隆擴增，促使Notch 1受體表達基點上調(diào)；同時T細胞亦對相關(guān)的細胞因子（如IL-1、IL-4、IL-10等）作出了一系列反應(yīng)、調(diào)節(jié)。T細胞在生長過程中由這些細胞因子通過信號傳導(dǎo)并且誘導(dǎo)進行定向分化[12]，Notch信號通路又通過一系列途徑促進淋巴細胞分化、增殖。Notch信號也可以通過調(diào)節(jié)淋巴細胞表面CD25的表達以及增強NF-κB的活性，促進干擾素-γ的分泌等途徑來促進淋巴細胞的增殖、活化[12-18]，除了 T 細胞，Palaga等[19]的研究顯示，Notch 信號也參與巨噬細胞免疫功能的調(diào)控。在本研究中，健康人和燒傷感染患者的外周血中都有Notch 1的表達，并且在燒傷感染患者的外周血中表達更高，提示機體在受到感染后通過上調(diào)Notch 1的表達來增強免疫系統(tǒng)的功能對抗入侵的病原微生物。

Notch 2作為Notch信號通路的一個重要受體，在機體的外周免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著復(fù)雜的生理病理作用。 秦亞錄等[20]的研究顯示，Notch 2、3、4-Jagged-1 介導(dǎo)的Notch信號通路激活與外周血炎癥因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）的高表達與Notch信號通路激活有關(guān)。采用基因敲除或者基因沉默方法的研究顯示，Notch 2信號可促進Th2分化，Notch 2或Notch 1信號通過促進GATA-3和IL-4的表達來誘導(dǎo)Th2分化。彭思璐等[21]的研究顯示，慢性乙型肝炎患者易感染病原菌，且感染后患者血清中Notch 1和Notch 2蛋白水平明顯升高，此結(jié)果與本課題的研究結(jié)果類似。

Notch信號通路對免疫系統(tǒng)的影響還有待進一步研究，筆者從臨床角度對Notch信號通路進行了初步的探索，遺憾的是，受條件所限本研究沒有得到進一步深入?？偠灾琍BL中Notch通路的Notch 1、Notch 2受體的表達與外周免疫系統(tǒng)的諸多生理和病理活動密切相關(guān)，通過檢測PBL中兩個重要Notch受體表達水平的變化，能夠為臨床醫(yī)生全面了解燒傷患者的感染程度和判斷預(yù)后提供有價值的參考，將Notch受體的表達變化作為參考指標(biāo)以選擇合適的治療方案，具有較高的臨床應(yīng)用價值。如果能將Notch 1和Notch 2受體聯(lián)合其他多種免疫細胞因子檢測，如抗炎因子、促炎因子等，有望進一步增加其敏感度和特異性，提高和拓展其臨床診斷與治療方面的應(yīng)用。