王晴晴,蔡為榮,汪玉玲,卓允允,黃偉,曹宇凡

(安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 蕪湖,241000)

咸鴨蛋在我國(guó)是最受歡迎的傳統(tǒng)蛋制品之一[1],咸蛋清蛋白是一種易被人體消化吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白,但咸蛋清因鹽含量高幾乎無法直接利用,將咸蛋清蛋白脫鹽酶解可增加其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值[2]。

鐵缺乏會(huì)導(dǎo)致缺鐵性貧血,可引起人體系統(tǒng)功能紊亂,對(duì)人體正常生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響。新型鐵補(bǔ)充劑多肽-鐵螯合物對(duì)比傳統(tǒng)的鐵補(bǔ)充劑更易消化吸收、性質(zhì)更穩(wěn)定且對(duì)人體無刺激性[3-4],逐漸成為人們理想的鐵補(bǔ)充劑。目前,關(guān)于多肽-鐵螯合物的研究有綠豆多肽-鐵螯合物[5]、阿拉斯加鱈皮多肽-鐵螯合物[6]、鳳尾魚肌肉蛋白多肽-鐵螯合物[7]等。LI等[8]利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得出DPs-Fe比硫酸亞鐵能更有效增強(qiáng)機(jī)體鐵吸收并減輕鐵缺乏的影響。多肽金屬螯合物對(duì)促進(jìn)細(xì)胞增殖的相關(guān)研究有白鰱魚骨膠原低聚肽螯合鈣[9]促進(jìn)293Ad5+人腎細(xì)胞的增殖、EWP-Ca促進(jìn) HFOB細(xì)胞的增殖[10]。Caco-2細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的吸收與利用和人小腸上皮細(xì)胞相似[11],利用Caco-2細(xì)胞可以較好地反映蛋清多肽-鐵螯合物對(duì)人體腸道細(xì)胞的影響。而關(guān)于蛋清多肽-鐵螯合物對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響未見相關(guān)報(bào)道。

本研究以咸蛋清為原料,脫鹽后優(yōu)化酶解條件,從粗肽中分離純化出鐵螯合能力較好的組分,制備蛋清多肽-鐵螯合物。利用掃描電鏡、能譜、紅外光譜和X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)分析蛋清多肽-鐵螯合物螯合前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,探究蛋清多肽-鐵螯合物的細(xì)胞促增殖作用,為蛋清多肽-鐵螯合物的開發(fā)和應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鴨蛋清,菜市場(chǎng)購(gòu)入;胰蛋白酶,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;鄰菲啰啉、氯化亞鐵、硫酸亞鐵,國(guó)藥試劑有限公司;96孔板(細(xì)胞級(jí)),康寧公司;菲啰嗪,阿拉丁有限公司;高糖DMEM,Hyclone公司;胎牛血清,Gemini公司;磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素抗體、CCK-8檢測(cè)試劑盒,碧云天生物技術(shù)有限公司;Caco-2結(jié)腸腺癌細(xì)胞,中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 儀器與設(shè)備

S-4800掃描電子顯微鏡,日本日立公司;DA7200傅里葉紅外光譜儀,瑞典波通公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀,賽默飛世爾儀器有限公司;DF101B數(shù)顯集熱式磁力攪拌器,常州市金壇大地儀器廠;PHSJ-5雷磁pH計(jì),上海雷磁儀器有限公司;LGJ-10真空冷凍干燥機(jī),松源華興科技發(fā)展有限公司;WJ-80B-Ⅱ恒溫培養(yǎng)箱,上海圣科儀器設(shè)備有限公司;TG16B離心機(jī),鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋清粉、蛋清多肽-鐵螯合物的制備

咸蛋清和超純水體積比1∶1混合后調(diào)節(jié)pH為3,60 ℃攪拌5 h后將pH值調(diào)節(jié)為5.6,離心(5 000 r/min,10 min)后棄上清液,沉淀與超純水以料液比(g∶mL)1∶2混合均勻重復(fù)離心,沉淀冷凍干燥后即為蛋清粉[12](含鹽量2 g/100 g)。

4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋清多肽溶液中加入維生素C,調(diào)節(jié)pH值為5.5,加入氯化亞鐵后40 ℃水浴螯合反應(yīng)40 min,加入無水乙醇醇沉后離心(10 000 r/min,10 min)棄去上清液,用無水乙醇反復(fù)洗滌沉淀,收集沉淀冷凍干燥得蛋清多肽-鐵螯合物[13]。

1.3.2 酶解工藝優(yōu)化

蛋清粉加入超純水溶解,加入胰蛋白酶[14]恒溫酶解,調(diào)節(jié)pH,酶解后沸水浴10 min,離心(5 000 r/min,15 min),上清液凍干后得蛋清粗肽。以鐵螯合能力和水解度(degree of hydrolysis,DH)為指標(biāo),評(píng)價(jià)底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(2%、4%、6%、8%,下同)、酶添加量(2%、4%、6%、8%、10%,質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)、pH(6.5、7、7.5、8、8.5)、溫度(35、40、45、50、55 ℃)、時(shí)間(1、2、4、6、8 h)對(duì)酶解上清液鐵螯合能力和DH的影響。在此條件下,利用正交試驗(yàn)得到最優(yōu)酶解條件。

1.3.3 DH的測(cè)定

采用 pH-Stat法測(cè)定DH[15],DH按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：B,酶解中加入的 NaOH溶液體積,mL;Nb, NaOH的濃度,mol/L;Mp,底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量,g;htot=9.143 8(鴨蛋清蛋白);α=[10(pH-pK)]/[1+10(pH-pK)],pH為酶解時(shí)pH值,pK=7.0。

1.3.4 鐵螯合能力的測(cè)定

1 mL待測(cè)溶液中加入 4 mL超純水和0.1 mL氯化亞鐵(2 mmol/L)混勻,20 min后加入0.5 mL菲洛嗪(2 mmol/L),反應(yīng)10 min后在562 nm下測(cè)定吸光度[16]。鐵螯合能力按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A1,樣品的吸光度值;A0,純水代替樣品的吸光度值。

1.3.5 超濾分離純化

蛋清粗肽依次通過50、10、3 kDa的超濾管,收集離心(4 000×g,30 min)后的上液和下液,分別得到分子質(zhì)量>50 kDa(F1)、50～10 kDa(F2)、10～3 kDa(F3)和<3 kDa(BZ)的4個(gè)組分,冷凍干燥,測(cè)定各組分的鐵螯合能力。

1.3.6 Sephadex G-15分離純化

將處理好的Sephadex G-15裝入層析柱(160 mm×80 cm),超純水沖洗平衡過夜。BZ組分用超純水溶解,過 0.22 μm針頭濾膜后上樣。洗脫液為超純水,流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm,分離后得4個(gè)組分(BZ-1、BZ-2、BZ-3、BZ-4)收集凍干并測(cè)定鐵螯合能力。

1.3.7 蛋清多肽-鐵螯合物的表征

1.3.7.1 掃描電子顯微鏡

將BZ-4及蛋清多肽-鐵螯合物固定在導(dǎo)電膠上,噴金處理后放入樣品室,施加電壓獲取微觀結(jié)構(gòu)圖。并對(duì)其進(jìn)行能譜分析[17]。

1.3.7.2 傅里葉紅外光譜

參考ZHU等[18]的方法,將BZ-4及蛋清多肽-鐵螯合物分別與干燥的 KBr充分研磨混合后壓片,在 400～4 000 cm-1進(jìn)行紅外掃描。

1.3.7.3 X射線衍射

取BZ-4及蛋清多肽-鐵螯合物分別壓片制樣,測(cè)試條件：管電壓 40 kV,速度8 deg/min,掃描角度5°～90°。

1.3.8 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.3.8.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)條件：DMEM高糖培養(yǎng)基[含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))雙抗],置于37 ℃飽和濕度、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2的培養(yǎng)箱,細(xì)胞融合至80%～90%后,棄去培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液清洗2次,加入胰酶消化6 min后收集至離心管,離心(800 r/min,3 min)后棄去上清液,加入培養(yǎng)基吹打均勻進(jìn)行傳代培養(yǎng),每3 d傳代一次。

1.3.8.2 細(xì)胞活力的測(cè)定

參考錢躍威等[19]方法,細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,以5×103個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種到96孔板中,培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵用DMEM培養(yǎng)基溶解過0.22 μm針頭濾膜,加入不同質(zhì)量濃度(0.05、0.1、0.5、1、5 mg/mL) 100 μL的上述樣品液,培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱放置2 h,在450 nm下測(cè)定吸光度。

不同刺激時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響：加入0.05 mg/mL的樣品液100 μL,分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入10 μL CCK-8溶液,培養(yǎng)箱放置2 h,在450 nm下測(cè)定吸光度。細(xì)胞活力按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：B1,加樣品的吸光度值;B0,不加細(xì)胞和樣品的吸光度值;B2,加細(xì)胞不加樣品的吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0軟件中的ANOVA和Duncan′s進(jìn)行數(shù)據(jù)分析比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用Origin 2018軟件作圖,實(shí)驗(yàn)3組平行對(duì)照,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

胰蛋白酶水解蛋清蛋白制備蛋清多肽的單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。鐵螯合能力隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而DH逐漸下降,原因是底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低,蛋清多肽含量較少,導(dǎo)致測(cè)得鐵螯合能力較低;過高則造成蛋白水解不完全?？紤]鐵螯合能力和DH兩個(gè)指標(biāo),選擇4%的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖1-a)。隨著酶添加量的增大,鐵螯合能力先上升后下降,DH持續(xù)增大后逐漸穩(wěn)定,在8%時(shí)達(dá)到最大值,此時(shí)酶基本與底物完全結(jié)合,飽和點(diǎn)后隨著酶添加量的增大,部分蛋白完全水解成氨基酸,導(dǎo)致鐵螯合能力降低(圖1-b)。pH過高或過低都會(huì)影響酶的活性,鐵螯合能力和DH隨著pH的增加先上升后下降,當(dāng)pH為8時(shí),DH和鐵螯合能力達(dá)到最高值(圖1-c)。酶解過程中隨著溫度的升高,鐵螯合能力和DH先上升后下降,在45 ℃時(shí),鐵螯合能力達(dá)到最大,原因是不同蛋白酶的最適溫度不同,溫度過高會(huì)導(dǎo)致酶活力下降甚至失活(圖1-d)。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),DH和鐵螯合能力先上升, 6 h后逐漸平穩(wěn)(圖1-e)。選取4因素,底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)(3%、4%、5%)、酶添加量(6%、8%、10%)、溫度(40、45、50 ℃),酶解時(shí)間(4、6、8 h),在pH 8條件下進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

a-底物濃度;b-酶添加量;c-pH;d-酶解溫度;e-酶解時(shí)間圖1 酶解條件對(duì)酶解產(chǎn)物鐵螯合能力和DH的影響

正交試驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如表1,本實(shí)驗(yàn)以制備鐵螯合肽為主要目的,以鐵螯合能力為指標(biāo),得最優(yōu)組合為A2B3C3D3,即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶添加量10%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間8 h,后續(xù)驗(yàn)證,所得酶解液鐵螯合能力為95.27%。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Orthogonal experimental design and results

2.2 超濾分級(jí)

超濾是一種分離功能性肽的常用方法[20],利用超濾管對(duì)2.1節(jié)中制備出的蛋清粗肽進(jìn)行分離,得到4個(gè)組分,其中BZ(<3 kDa)的鐵螯合能力為(4.13±0.052) mg/g(表2),顯著高于其他組分和未分級(jí)的粗肽(P<0.05),由此可知分子質(zhì)量小的蛋清多肽對(duì)鐵的螯合能力強(qiáng)。本研究結(jié)果與JIANG等[21]對(duì)藍(lán)圓鲹魚蛋白酶解物的研究結(jié)果相似,因此收集BZ組分進(jìn)行下一步分離。

表2 超濾分級(jí)組分鐵螯合能力 (n=3)Table 2 Iron-chelating capacity of ultrafiltration fractional components (n=3)

2.3 Sephadex G-15分離純化

凝膠過濾層析的分離原理是大分子多肽無法進(jìn)入凝膠顆粒的多孔結(jié)構(gòu)中首先被洗脫下來,小分子后被洗脫下來[22]。蛋清多肽BZ組分經(jīng) Sephadex G-15分離成4個(gè)組分(圖2-a),依次為BZ-1、BZ-2、BZ-3、BZ-4。其中BZ-4的鐵螯合能力為(31.56±0.503) mg/g,顯著高于其他3個(gè)組分(P<0.05)(圖2-b),比未分離前BZ組分提高了7.64倍。

a-Sephadex G-15 凝膠過濾層析色譜圖;b-各組分的鐵螯合能力圖2 BZ組分的 Sephadex G-15 凝膠過濾層析色譜圖和各個(gè)組分的鐵螯合能力

2.4 蛋清多肽-鐵螯合物結(jié)構(gòu)表征分析

2.4.1 掃描電鏡及能譜分析

BZ-4及蛋清多肽-鐵螯合物的掃描電鏡中,多肽呈不規(guī)則形狀(圖3-a),表面光滑且疏松多孔。與Fe2+螯合后,表面粗糙不平并形成了團(tuán)狀顆粒聚集體,組織結(jié)構(gòu)更加緊密(圖3-b)。這是由于多肽的羧基及氨基與Fe2+發(fā)生配位結(jié)合,而螯合物表面的顆粒可能是多肽與Fe2+反應(yīng)后吸附的鐵晶體。能譜圖中,與BZ-4相比,蛋清多肽-鐵螯合物有3個(gè)鐵元素的峰(圖3-c),而多肽圖中未出現(xiàn)(圖3-d)。綜上所述,多肽與Fe2+螯合形成穩(wěn)定的物質(zhì)。

a-BZ-4掃描電鏡圖;b-蛋清多肽-鐵螯合物掃描電鏡圖;c-BZ-4能譜圖;d-蛋清多肽-鐵螯合物能譜圖圖3 BZ-4和蛋清多肽-鐵螯合物的掃描電鏡及能譜圖

2.4.2 紅外光譜分析

圖4 BZ-4和蛋清多肽-鐵螯合物的紅外光譜圖

2.4.3 XRD分析

BZ-4及蛋清多肽-鐵螯合物的XRD圖中(圖5),多肽的特征衍射峰出現(xiàn)在衍射角為20°時(shí),與Fe2+螯合后的衍射峰發(fā)生了明顯的變化,衍射峰強(qiáng)度下降,衍射角偏移,表明蛋清多肽-鐵螯合物中形成了新的相互作用力,具有不同于多肽的非晶型結(jié)構(gòu)。

圖5 BZ-4和蛋清多肽-鐵螯合物的XRD圖

2.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中(圖6-a),在0.05、0.1、0.5、1 mg/mL蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵的作用下,細(xì)胞活力均在80%以上,但當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí),蛋清多肽-鐵螯合物處理的細(xì)胞活力下降到64.73%,蛋清多肽和硫酸亞鐵處理的細(xì)胞活力分別僅有33.01%和10.24%,這表明高濃度的蛋清多肽-鐵螯合物對(duì)細(xì)胞的毒性小于同濃度的蛋清多肽和硫酸亞鐵。

a-不同質(zhì)量濃度蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵的細(xì)胞活力;b-蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵不同刺激時(shí)間下的細(xì)胞活力圖6 蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵對(duì)Caco-2細(xì)胞活力的影響

為了進(jìn)一步研究刺激時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響,以0.05 mg/mL的蛋清多肽-鐵螯合物、蛋清多肽和硫酸亞鐵處理細(xì)胞(圖6-b),隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),在蛋清多肽-鐵螯合物作用下細(xì)胞活力呈上升趨勢(shì),說明細(xì)胞繼續(xù)分化和生長(zhǎng)。而蛋清多肽對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響,硫酸亞鐵處理后的細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì),進(jìn)一步證實(shí)了同濃度下蛋清多肽和硫酸亞鐵的毒性大于蛋清多肽-鐵螯合物。Fe2+毒性可能源于自由基的過度產(chǎn)生,自由基可能改變膜的穩(wěn)定性和穿透性,并隨后引發(fā)脂質(zhì)過氧化和DNA損傷[25]。

3 結(jié)論

本研究利用咸蛋清,脫鹽后經(jīng)胰蛋白酶水解,最優(yōu)工藝為底物濃度4%、酶添加量10%、pH 8、溫度50 ℃,酶解8 h,所得產(chǎn)物的鐵螯合能力為95.27%。利用超濾和Sephadex G-15分離出鐵螯合能力最高的組分為BZ-4,掃描電鏡、能譜顯示蛋清多肽與Fe2+發(fā)生螯合反應(yīng),紅外表明蛋清多肽與Fe2+結(jié)合的位點(diǎn)主要是氨基、羧基和酰胺基。XRD顯示多肽與Fe2+螯合后衍射峰偏移,衍射強(qiáng)度變小。這些結(jié)果證實(shí)了蛋清多肽-鐵螯合物的形成。Caco-2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明蛋清多肽-鐵螯合物與蛋清多肽和硫酸亞鐵相比,更加安全且具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。