王 露， 杭學(xué)宇， 宋 鑫， 王 芹， 張敏會

(淮安市疾病預(yù)防控制中心，江蘇淮安 223001)

咖啡因?yàn)橐环N嘌呤生物堿，是日常飲料中的主要成分?？Х纫蚴侵袠猩窠?jīng)系統(tǒng)的興奮藥，對心血管系統(tǒng)具有正性作用，還能促進(jìn)胃酸分泌等疾病。但若長期或大劑量攝入含咖啡因的飲料可能會引起高血壓、休克等心血管系統(tǒng)疾病和中毒[1 - 2]。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、選擇性高的檢測食品中咖啡因含量的方法。

磁性分離作為一種在化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3 - 5]中發(fā)展起來的分離技術(shù)，在磁場的作用力下，根據(jù)物質(zhì)的磁性差異，把磁性組分從非磁性組分中分離出來。磁性納米粒子通過表面改性或表面共聚，能與無機(jī)材料或高分子聚合物或有機(jī)物相結(jié)合形成核殼結(jié)構(gòu)復(fù)合微球，既具有磁性，表面又具有活性基團(tuán)，能夠進(jìn)一步修飾。將分子印跡聚合物作為固相萃取材料，具有成本低廉、制備容易、耐熱、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用[6 - 9]。其中表面印跡使印跡的結(jié)合位點(diǎn)盡可能在印跡聚合物的表面，不但會使模板分子更容易接近結(jié)合位點(diǎn)有利于模板分子的洗脫，而且會增加分子印跡聚合物的印跡識別位點(diǎn)[10]。同時，在外加磁場的作用下，磁性材料能夠很簡便地與溶液分離，具有分離效率高和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

本文成功合成以CoFe2O4-石墨烯為載體，多巴胺為功能單體和交聯(lián)劑，咖啡因?yàn)槟０宸肿又频玫拇判苑肿佑≯E材料。建立磁性固相萃取結(jié)合高效液相色譜-紫外檢測法(HPLC-UV)定量分析蜂蜜中的咖啡因。結(jié)果表明，建立的方法不但省時、高效、環(huán)保，而且方法的回收率、富集倍數(shù)、檢出限等均令人滿意，能夠滿足快速測定樣品中咖啡因的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TECNAI-12透射電子顯微鏡(荷蘭,The Netherlands)；EV7型振動樣品磁強(qiáng)計(jì)(美國，ADE公司)；KQ218型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；pHS-25型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；圓形磁鐵(20×5 mm)。Aglient高效液相色譜儀(美國,Agilent公司)：TC-C18色譜柱(150×4.6 mm，5 mm)，流動相為甲醇-水(40∶60，V/V)，流速0.5 mL/min，檢測波長274 nm，進(jìn)樣量5 μL。

咖啡因、石墨粉末、甲醇、乙醇、乙酸、Fe(NO)3·9H2O、Co(NO3)2·6H2O、H2O2、KMnO4、H2SO4、H3PO4，均為分析純，購于國藥集團(tuán)。0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)；多巴胺溶液(10 mmol/L)：稱取0.1896 g多巴胺，溶于水中并定容至100 mL。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 CoFe2O4-GO的制備

1.2.1氧化石墨烯(GO)的制備按照文獻(xiàn)方法[11]制備GO。制備步驟如下：稱取3.0 g石墨粉，加入400 mL的混合酸(H2SO4+H3PO4，V/V=9∶1)中。攪拌10 min，緩慢加入18 g KMnO4后，加熱至50 ℃并攪拌12 h。待反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，然后置于冰浴中再攪拌0.5 h。逐滴加入30%H2O2直至溶液變?yōu)榱咙S色，靜置過夜，棄去上層清液。依次用5%HCl和蒸餾水洗凈后干燥，然后溶于水中超聲1 h后高速離心，取下面沉淀烘干，即制得GO。

1.2.2CoFe2O4-GO的制備首先稱取上述制備的1.0 g GO溶于250 mL水中，超聲2 h。再稱取1.72 g Fe(NO)3·9H2O和0.62 g Co(NO3)2·6H2O溶于25 mL水中，混勻后，逐滴加入超聲過的GO懸浮液并劇烈攪拌，然后將混合液pH調(diào)至12.0。將混合液升溫至80 ℃，加入10 mL水合肼繼續(xù)攪拌直至溶液呈黑色，待溶液冷卻至室溫，依次用水和乙醇洗凈，用磁鐵分離，真空烘干，制備得CoFe2O4-GO。

1.2.3磁性分子印跡材料(CoFe2O4-GO@MIPs)的制備稱取20 mg上述制備CoFe2O4-GO，然后加入20 mL 10 mmol/L多巴胺溶液，20 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.5)和8 mg目標(biāo)分子咖啡因，反應(yīng)8 h。其中多巴胺既作為功能單體也作為交聯(lián)劑自聚合在CoFe2O4-GO表面，制備印跡聚合物。用磁鐵分離出固體產(chǎn)物，用水洗滌數(shù)次，真空干燥。模板分子用甲醇-乙酸(9∶1,V/V)混合液洗脫，直至檢測不出模板分子為止。真空干燥后即得到咖啡因磁性分子印跡聚合物(MMIPs)。同時，非印跡聚合物(NIPs)在制備過程中除不加入目標(biāo)物質(zhì)咖啡因，其余步驟與印跡聚合物一致。

1.3 樣品的吸附與富集過程

整個磁性固相萃取過程如下：于小燒杯中放入10 mg CoFe2O4-GO@MIPs，加入100 mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液。超聲10 min，然后用磁鐵分離固液兩相，倒出上層清液，加入2 mL水洗滌磁性分子印跡材料，用1.0 mL甲醇-乙酸(9∶1,V/V)混合液超聲洗脫后，待HPLC定量測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 CoFe2O4-GO@MIP的透射電鏡圖

圖1A和1B分別是CoFe2O4-GO和CoFe2O4-GO@MIPs的透射電鏡(TEM)圖像。由圖中可以看出所有的粒子為納米級，大小均勻，分散性均比較好。

圖1 CoFe2O4-GO(A)和CoFe2O4-GO@MIPs(B)的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM of CoFe2O4-GO(A) and CoFe2O4-GO@MIPs(B)

2.2 磁性分析

圖2 CoFe2O4(a)、CoFe2O4-GO(b)和CoFe2O4-GO@MIPs(c)的磁滯回線Fig.2 VSM magnetization curves of CoFe2O4(a),CoFe2O4-GO(b) and CoFe2O4-GO@MIPs(c)

圖2a、2b和2c分別是CoFe2O4、CoFe2O4-GO和CoFe2O4-GO@MIPs的磁滯回線曲線,三條磁滯曲線的形狀相似，CoFe2O4的飽和磁化強(qiáng)度為29.1 emu/g，而包裹了石墨烯層后，飽和磁化強(qiáng)度下降為24.6 emu/g，再包裹分子印跡聚合物后，飽和磁化強(qiáng)度下降為22.0 emu/g，表明該磁性吸附劑在外加磁場的作用下具有一定磁響應(yīng)特性。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1功能單體本實(shí)驗(yàn)在甲基丙烯酸、丙烯酰胺、對乙烯苯甲酸、和多巴胺4種物質(zhì)中選擇功能單體。以咖啡因?yàn)槟０宸肿?，分別在CoFe2O4-GO表面以甲基丙烯酸、丙烯酰胺、對乙烯苯甲酸、和多巴胺4種物質(zhì)為功能單體，分別合成4種磁性分子印跡材料。其形貌都呈有凹陷的納米粒子，分別來做回收實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲基丙烯酸和多巴胺回收率達(dá)到90%以上，丙烯酰胺和對乙烯苯甲酸的回收率僅在75%左右。其中多巴胺作為單體也能作為交聯(lián)劑，大大降低了有機(jī)試劑的污染。并且利用其可以自聚合在CoFe2O4-GO表面制備印跡聚合物，反應(yīng)條件簡單、易于控制印跡聚合物的形貌、結(jié)構(gòu)。所以最終選擇多巴胺為功能單體。同時實(shí)驗(yàn)考察了多巴胺和CoFe2O4-GO之間的比例對萃取效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)兩者質(zhì)量比為2∶1時，聚合物材料對樣品的吸附效果最好。

2.3.2模板分子濃度選擇合成時模板的濃度對材料吸附性能有著重要影響。為了選擇最佳模板分子濃度，實(shí)驗(yàn)考察了咖啡因在2～15 mg范圍內(nèi)的影響。隨著聚合液中咖啡因濃度的增大，回收率增大。因?yàn)槟０鍧舛仍礁?，形成的印跡膜的識別位點(diǎn)就越多。當(dāng)咖啡因濃度大于8 mg時，回收率減小，則有可能導(dǎo)致非特異性吸附增強(qiáng)，選擇性降低。所以選擇模板最佳質(zhì)量為8 mg。

2.3.3吸附時間為了提高本方法的準(zhǔn)確度和靈敏度，必須保證在吸附時間內(nèi)使待測物最大程度進(jìn)入到分子印跡的空穴中去。實(shí)驗(yàn)考察了時間為2～20 min對吸附的影響，隨著時間的增加，回收率增大，當(dāng)時間為10 min時達(dá)最大值之后保持平衡，故最佳時間選為10 min。

2.3.4CoFe2O4-GO@MIPs的用量為選擇最佳CoFe2O4-GO@MIP用量，實(shí)驗(yàn)考察了用量2～15 mg對吸附效率的影響。結(jié)果顯示，隨著用量的增大，咖啡因的回收率迅速增大，用量10 mg時回收率最大。大于10 mg后回收率幾乎保持不變，說明10 mg CoFe2O4-GO@MIPs足以吸附咖啡因。因此本實(shí)驗(yàn)選擇吸附劑CoFe2O4-GO@MIPs用量10 mg。

2.3.5洗脫劑及其體積分別以甲醇-水(1∶2,V/V)、甲醇-水(2∶1,V/V)、甲醇-乙酸(9∶1,V/V)混合溶液作為本實(shí)驗(yàn)的洗脫劑。結(jié)果顯示甲醇-乙酸(9∶1,V/V)混合液洗脫能力最好，這是由于乙酸破壞了咖啡因和印跡材料之間的氫鍵。為了進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，對洗脫劑的體積也進(jìn)行了考察。當(dāng)洗脫劑體積大于1 mL，回收率不再增大。最后洗脫劑選擇1 mL。

2.4 最大樣品體積和富集因子

在10 mg CoFe2O4-GO@MIPs條件下，保持咖啡因的總量為5 μg，改變樣品體積分別為10、20、50、100、150、200 mL進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3，當(dāng)待測樣品體積大于100 mL時咖啡因的富集回收率低于90%，因此富集咖啡因的最大試樣體積為100 mL。由于1 mL甲醇-乙酸(9∶1,V/V)混合液能定量洗脫目標(biāo)分子咖啡因，因此最大富集因子為 100。

2.5 CoFe2O4-GO@MIP吸附劑的穩(wěn)定性

良好的磁性分子印跡材料不僅要有較高的吸附能力和特異的識別性，還要具有良好的穩(wěn)定性。圖4顯示本實(shí)驗(yàn)中制備的CoFe2O4-GO分子印跡材料吸附劑能夠重復(fù)使用超過100次。

2.6 吸附容量

稱取10.0 mg制備的磁性分子印跡材料，加入至10 mL不同濃度(100、200、300、400、500 mg/L)的咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液中，在室溫下超聲萃取5 h后離心分離，取上清液過0.45 μm濾膜，用HPLC法檢測溶液中咖啡因濃度。同時做NIPs的吸附實(shí)驗(yàn)。根據(jù)吸附前后溶液中濃度的變化分別計(jì)算MIPs和NIPs對咖啡因的吸附容量。由上述靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)得磁性分子印跡材料的平衡吸附容量Qe與平衡濃度c的曲線如圖5。隨著咖啡因濃度的增大，吸附容量也逐漸增加，最后幾乎保持不變，吸附達(dá)到平衡。MIPs和NIPs的飽和吸附容量分別為39、15 mg/g。MIPs的吸附容量是NIPs的2.6倍，說明MIPs識別空穴對模板分子具有特異性識別能力，因此具有較高的吸附能力。

圖3 樣品體積對CoFe2O4-GO@MIPs吸附咖啡因的影響Fig.3 Effect of sample volume on the sorption of caffeine on CoFe2O4-GO@MIPs

圖4 吸附劑的重復(fù)性Fig.4 The repeatability of sorbent

2.7 CoFe2O4-GO@MIPs的選擇性

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下考察了CoFe2O4-GO@MIP在測定咖啡因時的抗干擾能力，結(jié)果如圖6。選擇了和咖啡因結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似的物質(zhì)：鳥嘌呤、次黃嘌呤、維生素B4、胞嘧啶、尿嘧啶、檸檬酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星來進(jìn)行選擇性分析。經(jīng)過咖啡因的CoFe2O4-GO@MIP處理的樣品，咖啡因的吸附效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他物質(zhì)，而經(jīng)非磁性分子印跡處理過的樣品，其他物質(zhì)吸附效率相差較小?？梢钥闯霰痉椒ň哂休^高的識別效果。

圖5 MIPs和NIPs對咖啡因的結(jié)合等溫線Fig.5 Binding isotherms of caffeine onto the MIPs and NIPs

圖6 咖啡因MIPs與NIPs吸附效率Fig.6 The adroption efficiency of MIPs and NIPs

2.8 分析特性

為了驗(yàn)證本方法用于定量分析的可行性，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制外標(biāo)校正曲線。考察了方法的線性范圍、檢出限、精密度、富集因子等。咖啡因在0.1～50 μg/L 范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系，線性方程為：A=0.0936+0.0329c，相關(guān)系數(shù)R2為0.9987，以3倍信噪比(S/N=3)所得檢出限為0.02 μg/L。用本方法對1 μg/L咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行5次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)為4.7%，富集因子為100。表明本方法能滿足實(shí)驗(yàn)選定目標(biāo)分析物的檢測要求，適宜實(shí)際樣品的快速檢測。

本實(shí)驗(yàn)采集超市里的蜂蜜等作為實(shí)際樣品，取2 g樣品溶于熱水中，超聲5 min，靜置樣品后過0.45 μm濾膜，備用上機(jī)。在優(yōu)化條件下進(jìn)行5次平行測定，同時做1、10 μg/L水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估方法的適用性和準(zhǔn)確性。檢測結(jié)果如表1所示，能滿足痕量分析的要求。

表1 蜂蜜樣品中咖啡因的測定 (n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用CoFe2O4-石墨烯分子印跡技術(shù)與高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)，建立了一種快速測定實(shí)際樣品中咖啡因新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CoFe2O4-石墨烯分子印跡聯(lián)用高效液相色譜法用于基質(zhì)復(fù)雜的樣品的測定可取得滿意的結(jié)果，對于拓寬磁性分子印跡技術(shù)的應(yīng)用范圍具有重要意義。