趙秋伶， 張振宇， 周廣原， 鄭 昊

(1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105；2.遼寧工程技術(shù)大學(xué)電子與信息工程學(xué)院，遼寧葫蘆島 125105)

恩諾沙星(Enrofloxacin,ENRX)是一種人工合成的氟喹諾酮類抗菌藥物[1]，被廣泛用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中，預(yù)防和治療各種動(dòng)物感染性疾病[2]。ENRX的大量使用造成其在動(dòng)物源性食品中殘留，威脅人類的身體健康，如可引起神經(jīng)中毒、腎功能損傷、過(guò)敏反應(yīng)等毒副作用，且有潛在的致癌作用，還會(huì)使病菌產(chǎn)生耐藥性[3 - 5]。世界各國(guó)均對(duì)喹諾酮類抗生藥的最高殘留限量(MRL)做出了嚴(yán)格限制。我國(guó)及美國(guó)均規(guī)定，牛、羊的脂肪與肌肉、奶、腎、肝中的MRL分別為100、100、200和300 μg/kg，豬、兔與家禽等其他動(dòng)物的脂肪與肌肉、肝、腎中的MRL分別為100、200和300 μg/kg[6 - 7]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道的ENRX殘留檢測(cè)方法主要有微生物法、色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、熒光法和分光光度法、毛細(xì)管電泳法和免疫學(xué)檢測(cè)法等[8 - 11]。免疫檢測(cè)方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確、分析成本底、樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適合大樣品量篩查，因而在實(shí)際生產(chǎn)中得到廣泛的應(yīng)用[12 - 13]?；诤怂徇m配體的酶聯(lián)分析法是一種新型的免疫分析方法[14]，用核酸適配體代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗體發(fā)展檢測(cè)方法，可以進(jìn)一步提高ENRX殘留檢測(cè)的靈敏度，另外核酸適配體不受外界環(huán)境的干擾，分析結(jié)果重現(xiàn)性高。本研究用自己篩選獲得的ENRX核酸適配體作為識(shí)別探針，建立了一種用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中ENRX殘留的競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)分析方法。研制了ENRX酶聯(lián)分析試劑盒，為ENRX殘留檢測(cè)提供一種新的參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與材料

Spectra Max Paradigm多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)，Molecular Devices公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó),Millipore公司)；Heal Force臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、微量可調(diào)移液器(德國(guó)，Eppendorf公司)。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、加替沙星、氯霉素、萊克多巴胺(純度>99%，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。ENRX核酸適配體序列，3′端生物素(biotin)標(biāo)記：5′-GAAACGAGGTGCTTGACGGTACGATGTTATACCGGGTTAC-biotin-3′(A1)；和A1部分互補(bǔ)的核酸序列，5′端異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記：5′-FITC-ATTACCGTCAAGCACCTC-3′(B1)；和B1完全互補(bǔ)的核酸序列：5′-biotin-GAGGTGCTTGACGGTAAT-3′(C1)，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。Anti-FITC-HRP購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；恩諾沙星酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，購(gòu)自江蘇江萊ELISA研究所；其它試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試劑盒的組裝

試劑盒組成(96個(gè)反應(yīng)/盒)見(jiàn)表1。使用方法如下：(1)固定DNA：首先向固定磷酸鹽緩沖液(PBS)中加入A1 200 nmol/L和B1 500 nmol/L，于37 ℃孵育20 min形成部分互補(bǔ)的dsDNA。鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板用200 μL磷酸鹽-吐溫緩沖液(PBST)洗滌三次，每次5 min。然后在酶標(biāo)板每孔加入100 μL含A1和B1的dsDNA溶液，置于37 ℃搖床，反應(yīng)2 h。反應(yīng)完畢移去反應(yīng)液，凹槽用PBST洗滌三次，保留待用(凹槽1)。用相同的方法在另一鏈霉親和素修飾的酶標(biāo)板的凹槽上固定DNA C1(C1的濃度為300 nmol/L)，保留待用(凹槽2)。(2)檢測(cè)ENRX：ENRX用結(jié)合緩沖液稀釋成不同濃度，加入到待用凹槽1，每口100 μL，室溫反應(yīng)30 min；反應(yīng)完畢，用移液器吸出反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到待用凹槽2，37 ℃搖床反應(yīng)20 min；然后移去反應(yīng)液，用PBST洗滌三次，每次5 min，每口加100 μL anti-FITC-HRP，37 ℃反應(yīng)30 min，移去反應(yīng)液，洗滌三次，最后加100 μL TMB-H2O2底物顯色液，反應(yīng)20 min，加25 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。反應(yīng)液由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

表1 試劑盒的組成

1.3 食品樣本檢測(cè)

(1)添加回收實(shí)驗(yàn)：選取新鮮肌肉組織(高效液相色譜法已驗(yàn)證無(wú)ENRX)作為添加回收實(shí)驗(yàn)樣品。其前處理方法如下：稱取均質(zhì)后肌肉組織3份，每份各1 g，置于3個(gè)15 mL離心管中，分別添加25、50、100 ng ENRX標(biāo)準(zhǔn)品，靜置10 min后分別加入4 mL超純水，充分振蕩均勻，然后用離心機(jī)以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分別吸取上層清液2 mL于3個(gè)10 mL離心管中，加入2 mL正己烷，振蕩10 min，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，除去上層正己烷層，取下層清液50 μL待測(cè)。

(2)實(shí)際樣品檢測(cè)：從興城南關(guān)集貿(mào)市場(chǎng)采集鮮肉樣本，共30份，依照添加回收實(shí)驗(yàn)的處理步驟處理鮮肉樣品。用研制的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用商用的酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒做對(duì)照和驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)策略

核酸適配體A1擁有40個(gè)堿基序列，前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明和ENRX作用的結(jié)合域包含在5′端的16個(gè)堿基里，而非后面的莖-環(huán)序列[15]?；贏1核酸適配體的結(jié)合域位于一端且不形成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)分析檢測(cè)策略，見(jiàn)圖1。當(dāng)A1的3′端生物素標(biāo)記可以被固定到鏈霉親和素標(biāo)記的酶標(biāo)板上。B1共18個(gè)堿基，除了5′端的兩個(gè)堿基之外，其余16個(gè)堿基和A1中5′端的16個(gè)堿基互補(bǔ)配對(duì)，見(jiàn)圖1中A1和B1粗體部分。B1與A1能形成部分互補(bǔ)的dsDNA，通過(guò)雜交作用，B1也被固定到酶標(biāo)板上。加入ENRX后，由于ENRX同其適配體的親和力大于雙鏈互補(bǔ)力，形成穩(wěn)定的ENRX/aptamer復(fù)合物，F(xiàn)ITC標(biāo)記的B1自dsDNA上解離下來(lái)。取出含B1的溶液轉(zhuǎn)移到固定了C1的酶標(biāo)板凹槽，通過(guò)雙鏈互補(bǔ)配對(duì)原則，B1被C1捕獲。FITC能捕獲帶HRP標(biāo)簽的FITC抗體，HRP能催化TMB底物顯藍(lán)色，加入2 mol/L酸后藍(lán)色產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

圖1 競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適配體分析的示意圖Fig.1 Detection principle diagram of enzyme-linked aptamer assay with competition replacement mechanism

2.2 檢測(cè)結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 (A)檢測(cè)不同濃度ENRX的照片；(B)450 nm的紫外吸收與ENRX濃度的關(guān)系曲線(插圖(C)為(B)曲線中的線性部分)Fig.2 (A)Photographs of detecting different concentrations of ENRX;(B)Relationship between the UV absorption of 450 nm and the concentration of ENRX;(Inset:(C)is the linear part of (B) curve)The experimental conditions：[A1]=20 pmol/well,[B1]=50 pmol/well,[C1]=30 pmol/well,[ExoI]=5 U/well,[anti-FITC-HRP]=12.5 ng/well,[TMB]=1.2 mmol/L.The error bar represented the standard deviation of the three independent experiments.

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，競(jìng)爭(zhēng)取代酶聯(lián)適配體分析試劑盒測(cè)定不同濃度ENRX的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(A)照片可以看出，隨著ENRX濃度的增加，溶液的顏色逐漸加深。肉眼觀察的檢測(cè)限為200 nmol/L(相當(dāng)于72.0 μg/kg)。相應(yīng)的，從圖2(B)可以看出，隨著ENRX濃度的增加，A450吸光度不斷增大，開(kāi)始時(shí)增加很快，后來(lái)趨于緩慢。在100～700 nmol/L(相當(dāng)于35.9～251.6 μg/L)范圍內(nèi)，在450 nm處的凈吸收值(A450-A450(blank))與ENRX的濃度呈良好的線性關(guān)系(圖2(C))。以信噪比大于3為可測(cè)信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到ENRX的檢測(cè)限為75.0 nmol/L(相當(dāng)于26.9 μg/L)。歐盟對(duì)ENRX在肌肉組織中的最大殘留限量(MRL)作出明確規(guī)定，要求不高于30 μg/kg。我國(guó)對(duì)動(dòng)物源性食品中ENRX的要求是肌肉組織中ENRX的MRL不高于100 μg/kg。所以，研制的試劑盒可以滿足我國(guó)規(guī)定的檢測(cè)需求，也能滿足歐盟高標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)需求。

2.3 試劑盒檢測(cè)性能評(píng)價(jià)

2.3.1添加回收實(shí)驗(yàn)及精密度采用上述研制的酶聯(lián)適配體分析試劑盒，對(duì)豬肉、羊肉、魚(yú)肉進(jìn)行檢測(cè)，分別添加25、50、100 ng/g 3個(gè)濃度水平的ENRX，取同一批次包被板，對(duì)同種樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)，再取不同批次的包被板，對(duì)同種樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算批間變異系數(shù)，分別得到相同及不同批次樣品的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知所建立方法對(duì)實(shí)際樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合檢測(cè)要求。

表2 鮮肉樣品添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)

2.3.2特異性選擇諾氟沙星、加替沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、萊克多巴胺作為參照物，在相同測(cè)試條件下，當(dāng)ENRX的濃度為1 μmol/L，而其它物質(zhì)濃度為10 μmol/L時(shí)，比較450 nm波長(zhǎng)處的凈吸收值(凈吸收值=A450-A450(blank))，并計(jì)算交叉反應(yīng)率P/N(P為對(duì)照物的凈吸收值，N為ENRX的凈吸收值)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，交叉反應(yīng)率P/N均小于4%，與環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星的交叉反應(yīng)率分別為3.46%、2.89%和2.33%，與其他結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率均小于2%，說(shuō)明除了加入恩諾沙星的體系外，其它體系檢測(cè)結(jié)果的凈吸收值都沒(méi)有明顯的提高(即使其它6個(gè)參照物濃度提高了10倍)，表明該方法對(duì)ENRX的檢測(cè)具有較高的特異性。

2.3.3穩(wěn)定性試劑盒經(jīng)-20 ℃到室溫的反復(fù)凍融后的測(cè)試結(jié)果顯示，反復(fù)凍融60次后An/A0為0.86，0.86>0.8，說(shuō)明檢測(cè)體系的凈吸收值沒(méi)有明顯變化，即試劑盒穩(wěn)定性良好。

2.3.4保存期限試劑盒保存前測(cè)得的凈吸收值為A0，試劑盒保存一段時(shí)間取出后測(cè)得的凈吸收值為Am，計(jì)算Am/A0，當(dāng)Am/A0≤0.8時(shí)，認(rèn)定試劑盒失效。由表3有效期試驗(yàn)結(jié)果可知，試劑盒在37 ℃，保存一周失效。試劑盒在4 ℃可以保存半年以上，試劑盒在-20 ℃可保存3年。

表3 試劑盒有效期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.5成本分析試劑盒中的成分除了DNA和Anti-FITC-HRP都是常規(guī)試劑。就目前合成技術(shù)，DNA已能夠批量合成，合成2 OD用量時(shí)上去一個(gè)堿基10元左右，做96口反應(yīng)需DNA 0.4～0.6 OD；100 μL Anti-FITC-HRP 395美元，做96口反應(yīng)需2 μL足夠。再加上其它試劑，一個(gè)能做96口反應(yīng)的試劑盒大約四百元，比市售的常規(guī)酶聯(lián)免疫分析試劑盒便宜。隨著DNA合成技術(shù)的進(jìn)步，如果能在DNA上直接標(biāo)記HRP，將不必使用Anti-FITC-HRP，還將大大降低成本。

2.4 食品樣品檢測(cè)

應(yīng)用本試劑盒檢測(cè)興城南關(guān)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集的30個(gè)鮮豬肉樣本，結(jié)果18個(gè)樣本檢出有ENRX殘留，其中5個(gè)樣本的殘留量在42.3～100.2 μg/kg之間，低于我國(guó)規(guī)定的最大殘留限量，13個(gè)樣本的殘留限量在101.3～182.0 μg/kg之間，高于我國(guó)規(guī)定的最高殘留限量。我們研制的試劑盒的檢測(cè)結(jié)果和商用的ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果基本一致，ELISA試劑盒也檢出18個(gè)樣本有ENRX殘留，殘留量在40.1～158.4 μg/kg之間。說(shuō)明研制的試劑盒可信度高，能用于檢測(cè)實(shí)際樣本中的ENRX殘留。

3 結(jié)論

本文研制了ENRX的酶聯(lián)適配體分析檢測(cè)試劑盒，該試劑盒的檢測(cè)限為26.9 μg/L，線性檢測(cè)范圍為35.9～251.6 μg/L；應(yīng)用于各樣品的添加回收率均落在93%～110%之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%；與結(jié)構(gòu)類似物和功能類似物的交叉反應(yīng)率都小于4%；在-20 ℃環(huán)境中，能保存3年以上，在4 ℃環(huán)境中，能保存6個(gè)月以上；穩(wěn)定性好，抵抗反復(fù)凍融至少60次。本文研制的試劑盒的靈敏度高、特異性強(qiáng)，具有準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足動(dòng)物源性食品中ENRX的快速篩查的需求。