王嘉翼 樊雙虎 任超 王俊歡 楊婷 賈陽 李先軍 閆艷春

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

鄰苯二甲酸酯（Phthalic acid eaters，PAEs）是一類重要的工業(yè)原料，常見的PAEs包括鄰苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（Diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二辛酯（Dioctyl phthalate，DOP）、鄰苯二甲酸甲苯基丁酯（Butyl benzyl phthalate，BBP）和鄰苯二甲酸二乙基己酯（di-2-ethylhexyl phthalate，DEHP）。PAEs主要用作增塑劑，以增強(qiáng)塑料制品的柔韌性、可塑性和耐用性，此外還用作油漆、化妝品、殺蟲劑等中的化學(xué)添加劑［1-2］。在塑料中，PAEs與塑料基質(zhì)并非以共價鍵的形式結(jié)合，因此在塑料的在生產(chǎn)、使用和廢物處理過程中，PAEs會從塑料中滲漏并進(jìn)入環(huán)境［3］。DBP作為一種被廣泛應(yīng)用在實(shí)際生活中的鄰苯二甲酸酯，環(huán)境中也是普遍存在。DBP在水中和和沉淀物中的濃度范圍分別為1.0-13.5 μg/L和0.3-30.3 μg/g［4］。大量研究表明，PAEs具有環(huán)境雌激素效應(yīng)，影響人體和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。PAEs還具有致畸致癌致突變的“三致效應(yīng)”，主要表現(xiàn)在肝臟毒性、生殖毒性方面，如DBP可誘發(fā)肝細(xì)胞癌變。體外研究表明，DBP和BBP能抑制胚胎肢芽細(xì)胞的生長和分化，對成熟的大鼠和魚類有抗雄性激素和抗雌性激素的作用［5］。目前，DMP，DEP，BBP，DBP，DOP 和 DEHP 已被美國環(huán)保局（EPA）列為優(yōu)先控制的污染物。

PAEs在自然環(huán)境中極難降解，DEHP在環(huán)境中的半衰期長達(dá)2000年。PAEs 通過非生物途徑降解如光解和水解的速度都很慢，且對環(huán)境造成二次污染。微生物代謝是一個酶促反應(yīng)過程，對PAEs降解速率快，成本低，無二次污染，是PAEs 降解的主要途徑。因此，PAEs 高效降解菌株的篩選對消除PAEs環(huán)境污染具有重要意義［6］。目前，許多學(xué)者已經(jīng)從受污染的土壤、污泥等環(huán)境中分離純化到大量的能快速降解PAEs的微生物。本實(shí)驗(yàn)室分離的戈登氏菌（Gordoniasp.）YC-RL2和分支桿菌（Mycobacteriumsp.）YC-RL4高 效 降 解 DEHP、DBP、BBP和DCHP等多種PAEs，質(zhì)譜分析表明菌株通過酯鍵的逐步水解將PAEs轉(zhuǎn)化成鄰苯二甲酸單酯、鄰苯二甲酸（Phthalic acid，PA）［7-8］。陳濟(jì)安等［9］從活性污泥中分離的Microbacteriumsp. strain CQ0110Y，能將濃度在1 350 mg/L及以下的DEHP在10 d內(nèi)完全降解，當(dāng)濃度提高到2 000 mg/L時，10 d內(nèi)DEHP的降解率在85%以上。

DBP是生活中應(yīng)用最廣泛的增塑劑之一，實(shí)驗(yàn)以DBP作為底物從受石油污染的土壤中分離到一株DBP降解菌，研究了溫度，pH和鹽度對其降解能力的影響，確定降解的最適條件。通過降解產(chǎn)物的確定，分析確定菌株對DBP的基本代謝途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集與處理 土壤樣品采集于受石油嚴(yán)重污染的土壤中，采樣前對采樣的玻璃器皿進(jìn)行清洗并121℃高溫高壓滅菌20 min。用鋼鏟除去各個采樣點(diǎn)上層15 cm的土層后取樣，樣品內(nèi)同時含有水樣和土壤樣品。將所有采樣點(diǎn)的樣品混合裝入已滅菌的玻璃器皿中密封，放置在裝有冰袋的保溫箱中，并于24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放入冰箱4℃保藏。

1.1.2 藥品與實(shí)驗(yàn)試劑 該實(shí)驗(yàn)中所使用的化學(xué)藥品均為分析純，DBP等其他鄰苯二甲酸酯購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；甲醇為HPLC級，購自于Fisher 公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自于Oxiod 公司；NaCl等無機(jī)鹽試劑，購自于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；基因組提取試劑盒、純化試劑盒、rTaq 酶及核酸Marker購自于TaKaRa 公司；熒光核酸染料，購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖購自于天根生化科技（北京）有限公司；引物合成與測序均送往上海生工生物公司。

1.1.3 培 養(yǎng) 基 Luria-Bertani培 養(yǎng) 基（LB，pH 7.0）含有胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。無機(jī)鹽培養(yǎng)基（TEM pH 7.0）含有（NH4）2SO42.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.01 g/L，微量元素溶液100 μL/L。微量元素溶液配置方法如下：將FeSO4·7H2O 5 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，CuSO4·5H2O 0.03 g，MnSO4·2H2O 1.43g，CoSO4·7H2O 0.12 g，Na2MoO4·2H2O 0.02 g，Na2WO4·2H2O 0.23 g溶于100 mL H2O。LB和TEM固體培養(yǎng)基按1.5%添加瓊脂粉，所有的培養(yǎng)基都應(yīng)121℃高溫高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 DBP降解菌株的篩選與形態(tài)特征 將DBP溶于甲醇中，配制成20 g/L的母液。在250 mL的錐形瓶中加入TEM液體培養(yǎng)基100 mL，土壤樣品5 g，DBP濃度為100 mg/L。置于恒溫振蕩器中150 r/min、30℃培養(yǎng)5 d。將上述培養(yǎng)液按2%重新接至含有100 mg/L DBP的TEM液體培養(yǎng)基中，同條件培養(yǎng)5 d。重復(fù)進(jìn)行5次富集，DBP的濃度保持不變。

取150 μL最終富集的培養(yǎng)液在含有100 mg/L DBP 的TEM固體培養(yǎng)基上均勻涂布，平板放置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至長出單菌落。分別挑取表型不同的單菌落于含有100 mg/L DBP的TEM固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行劃線分離，重復(fù)劃線至TEM固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)形態(tài)特征一致的單菌落，平板4℃保存?zhèn)溆?。挑取單菌落接入含?00 mg/L DBP的TEM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入30%甘油，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑取單菌落接入含?00 mg/L DBP的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，經(jīng)固定液處理后用于掃描電鏡觀察。

觀察菌落的形態(tài)及特征，根據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊，對分離到的DBP降解菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)［10］。

1.2.2 16S rDNA 序列分析 采用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，用通用引物27F（5′-AGTTTGACMTGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對16S rDNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系如下：PCR premix buffer（TaKaRa）25 μL，正反向引物各 1.5μL，ddH2O 20 μL 和 2 μL 的細(xì)菌基因組 DNA。PCR循環(huán)參數(shù)如下：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，上述循環(huán)重復(fù)34次，最后一次延伸10 min。

PCR產(chǎn)物純化之后與pEASY-T1 克隆載體連接，連接體系如下：PCR產(chǎn)物4 μL，p-EASY-T1載體1 μL混合均勻后，放置37℃金屬浴反應(yīng)10 min。將連接產(chǎn)物加入至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻，冰浴30 min。42℃金屬浴熱激60 s，冰浴2 min。加入500 μL平衡至室溫的LB培養(yǎng)基，180 r/min，37℃培養(yǎng) 1 h。取 16 μL 250 mmol/L IPTG 和 40 μL 20 mg/mL X-gal混合，均勻涂在LB平板上，待全部吸收后，再將200 μL菌液均勻地涂在平板上，37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日，挑取白斑送至生工測序公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果提交至GenBank（NIH，Bethesda，MD，USA）并用BLAST將其與GenBank已知序列進(jìn)行比對，并用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株YC-JY1對DBP的降解驗(yàn)證 根據(jù)已有文獻(xiàn)報道，將起始溫度設(shè)為30℃，培養(yǎng)基的pH設(shè)為7.0。將單菌落接種至含有100 mg/L DBP的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6-1.0，取出1 mL 菌液12 000 r/min 離心2 min，用TEM液體培養(yǎng)基（pH 7.0）吹打清洗兩次。為驗(yàn)證菌株YC-JY1以DBP作為唯一的碳源進(jìn)行生長，將菌株YC-JY1以2%接菌量分別接至不添加任何碳源的TEM液體培養(yǎng)基中和只有甲醇為唯一碳源的TEM液體培養(yǎng)基中。再以同樣的接菌量接入至含有100 mg/L DBP 的10 mL TEM液體培養(yǎng)基中，150 r/min、30℃培養(yǎng)5 d，未接菌的樣品作為空白對照。驗(yàn)證菌株YC-JY1能夠以DBP作為唯一碳源并測定菌株YC-JY1的生長曲線及其對DBP的降解率。

1.2.4 DBP降解的最適條件 為測定pH對菌株YCJY1降解DBP的影響，培養(yǎng)溫度初始設(shè)為30℃，pH 2.0-13.0。將菌株YC-JY1按2%接菌量接入含有100 mg/L DBP的10 mL TEM液體培養(yǎng)基中，150 r/min培養(yǎng)5 d，未接菌的樣品作為空白對照，每個pH設(shè)置5個重復(fù)。5 d后氣相色譜儀（GC）測DBP的含量，計算降解率，確定最適pH。在最適pH條件下，溫度設(shè)置為15-40℃，每5℃為一個梯度，培養(yǎng)方式與上述方法相同，確定菌株最適的降解溫度。

1.2.5 NaCl含量對菌株YC-JY1降解DBP的影響 添加NaCl（含量為0%、2%、4%、6%、8%和10%）至含有100 mg/L DBP的TEM液體培養(yǎng)基中。將菌株YC-JY1按2%接菌量接入培養(yǎng)基中，最適條件下，150 r/min培養(yǎng)5 d，未接菌的樣品作為空白對照，考查鹽度對菌株降解能力的影響。

1.2.6 菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度 將菌株按2%的接菌量接入10 mL TEM液體培養(yǎng)基中，同時分別加入100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L、900 mg/L和1 000 mg/L不同濃度的DBP作為底物。最適條件下，150 r/min培養(yǎng)5 d，未接菌的樣品作為空白對照。

1.2.7 菌株YC-JY1對其他PAEs的利用 為檢測菌株YC-JY1對不同PAEs的利用能力，讓其在分別含有以下PAEs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為底物的PAEs為：鄰苯二甲酸二丙酯（DPrP）、DBP、DPeP、DHP、鄰苯二甲酸二庚酯（DHPP）、DOP、鄰苯二甲酸二壬酯（DNP）、鄰苯二甲酸二癸酯（DDP）、DCHP、BBP，濃度均為100 mg/L。接菌量仍為2%，在最適條件下，150 r/min培養(yǎng)5 d，每種底物設(shè)置5個重復(fù)，未添加菌株的樣品作為空白對照。記錄培養(yǎng)基中菌株YC-JY1的生長情況，有明顯生長記作（+ +），不明顯生長記作（+）。

1.2.8 DBP代謝產(chǎn)物的確定和代謝途徑的推測 DBP的中間代謝產(chǎn)物通過HPLC-MS分析，并由此推測菌株YC-JY1對DBP的代謝途徑。以2%接菌量接入含有100 mg/L DBP的10 mL的TEM液體培養(yǎng)基中，最適條件下，150 r/min培養(yǎng)3 d，設(shè)置3個重復(fù)。3 d后，處理樣品并用于HPLC-MS分析。

1.2.9 PAEs的分析方法 所有的降解實(shí)驗(yàn)均在5 d后使用GC測定樣品中的PAEs殘留量。樣品中加入等體積的正己烷，搖晃震蕩1 min。待水相與有機(jī)相分離后，取有機(jī)相1 mL于樣品瓶中用于GC分析。

GC分析儀器和參數(shù)如下：島津氣相色譜儀2010，F(xiàn)ID檢測器，RTX-1301毛細(xì)管柱（30.0 m × 0.25mm × 0.25 μm）。載氣為氮?dú)猓兌取?99.999%，流速為30 mL/min）；進(jìn)樣口溫度300℃，柱溫280℃，檢測器300℃；進(jìn)樣量為1 μL，GC分析軟件（版本2.32.00，SHIMADZU）分析GC檢測結(jié)果，計算降解率。

1.2.10 HPLC-MS分析方法 首先用2M HCl對已培養(yǎng)3 d的樣品進(jìn)行酸化，調(diào)至樣品pH 至2.0-3.0。加入等體積乙酸乙酯，搖晃震蕩1 min，待有機(jī)相與水相完全分離后，取出全部有機(jī)相。氮?dú)獯抵敝翗悠分幸宜嵋阴ネ耆珦]發(fā)，1 mL 甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于HPLC-MS檢測。

HPLC-MS 儀器與分析參數(shù)如下：安捷倫高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜（HPLC-QQQ，1260-6420）對樣品進(jìn)行檢測。質(zhì)譜配置電噴霧電離源（ESI）和Zorbax Eclipse Plus C18 柱，柱溫維持在30℃。流動相是水和甲醇（10∶90），流速 0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，樣品直接進(jìn)入質(zhì)譜儀。ESI-MS分析環(huán)境如下：載氣（325℃）為高純氮?dú)猓?9.999%），流速為 8 L/min，毛細(xì)管電壓為3.5 kV。通過負(fù)離子掃描模式進(jìn)行檢測，掃描范圍為 50-400 m/z，通過 Mass hunter（version A.02.00，USA）對結(jié)果進(jìn)行收集及數(shù)據(jù)分析［11］。

2 結(jié)果

2.1 鄰苯二甲酸酯降解菌的分離與形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)多輪富集和篩選純化，在受石油污染的土壤中分離出一株可利用DBP作為唯一碳源進(jìn)行生長的菌株。該菌株菌落呈圓形，表面光滑呈黃色，不透明，在平板上生長狀態(tài)如圖1所示。通過掃描電鏡觀察，菌株YC-JY1為桿狀，大小約為 （0.36 μm-0.44 μm）×（1.22 μm-1.44 μm）（圖 2）。

圖1 菌株YC-JY1在TEM固體培養(yǎng)基上的生長

圖2 菌株YC-JY1的掃描電鏡照片

提取細(xì)菌總DNA 并選用細(xì)菌通用引物27F和1 492R擴(kuò)增16S rDNA 基因，擴(kuò)增產(chǎn)物序列長度為1 445 bp，如圖3所示。根據(jù)測序結(jié)果，所獲得的序列提交至GenBank，登錄號為MH152572。利用BLAST 軟件與GenBank 中已登錄的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比較，MEGA 7.0 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。經(jīng)過比較，菌株YCJY1與Xanthobacter aminoxidans14a（GenBank：AF399969.1） 和Xanthobacter flavus301（GenBank：X94199.1）具有100% 的同源性，因此確定菌株屬于黃色桿菌屬（Xanthobactersp.）。

2.2 菌株YC-JY1對DBP的降解及生長曲線

如圖4所示，菌株YC-JY1在TEM液體培養(yǎng)基、在只含有甲醇的TEM液體培養(yǎng)基中均無生長；在含有DBP的TEM液體培養(yǎng)基的樣品中，明顯由無色變?yōu)榈S色，生長現(xiàn)象明顯。由此可知，菌株YCJY1可以將DBP作為唯一碳源進(jìn)行生長。

圖3 菌株YC-JY1的16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

圖4 菌株利用DBP作為唯一碳源的生長

DBP的降解率與菌株YC-JY1的OD600值呈正相關(guān)，在5 d內(nèi)被菌株YC-JY1完全降解（圖5）。

2.3 菌株YC-JY1降解DBP的最適條件

如圖6所示，菌株YC-JY1降解DBP的最適pH為7.0，DBP降解率100%；pH4.0-6.0，DBP的降解率為15%-60%；pH8.0-11.0，DBP的降解率為30%-80%；pH12.0-13.0，DBP的降解率為10%左右；pH2.0-3.0，菌株YC-JY1不降解DBP。數(shù)據(jù)說明，偏堿性環(huán)境更適合菌株YC-JY1降解DBP。

圖5 菌株YC-JY1對DBP的降解和生長曲線

圖6 pH對菌株YC-JY1 降解DBP的影響

如圖7所示，菌株YC-JY1降解DBP的最適溫度為30℃，DBP降解率為100%；20℃-35℃，DBP降解率在40%以上；15℃和40℃，DBP無降解。所有pH，溫度的對照組中，DBP起始濃度與終濃度無明顯變化，菌株YC-JY1無生長跡象。

圖7 溫度對 YC-JY1 降解DBP的影響

2.4 NaCl對菌株YC-JY1降解DBP的影響

DBP的降解率如圖8所示。培養(yǎng)5 d之后，未添加NaCl 的樣品中，DBP被完全降解；NaCl 含量上升到2%時，DBP的降解率迅速下降到35%；NaCl 含量超過2%時，DBP的降解率穩(wěn)定在10%左右，由此說明菌株YC-JY1并沒有表現(xiàn)出明顯的耐鹽能力。

圖8 NaCl的添加對菌株YC-JY1降解DBP的影響

2.5 菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度

驗(yàn)證菌株YC-JY1 對DBP的最大耐受濃度，結(jié)果如圖9所示，培養(yǎng)5 d后，100 mg/L 的DBP 能夠被完全降解；200 mg/L-400 mg/L DBP的降解率在94%以上；500 mg/L-1000 mg/L DBP降解率在24%-77%之間。由此可知，菌株YC-JY1對DBP的最大耐受濃度為400 mg/L。對于更高濃度的DBP降解，菌株YC-JY1可能需要更長的時間。

圖9 YC-JY1對DBP的最大耐受度

2.6 菌株YC-JY1的底物譜

菌株YC-JY1在以各種PAEs為底物的TEM液體培養(yǎng)基中的生長情況，如表1所示。

GC 檢測樣品中各種PAEs殘留量，通過計算，得到的降解率如圖10所示。從數(shù)據(jù)中可以得出，菌株YC-JY1能否降解該底物，與在培養(yǎng)基中的生長情況是相關(guān)的。菌株YC-JY1在分別以DBP、DPeP、DHP作為唯一碳源的樣品中，菌株有明顯生長，相應(yīng)的PAEs降解率在90%以上；在分別以DPrP、DHPP、DOP、DNP、DDP、DCHP、BBP為唯一碳源的樣品中，菌株有生長，但不明顯，此時相應(yīng)的PAEs降解率在10%-60%。綜上所述可知，菌株的生長與對PAEs降解能力是相符合的。

表1 菌株YC-JY1以PAEs作為底物的生長情況

圖10 YC-JY1 對PAEs的降解

菌株YC-JY1可以利用不同類型的PAEs，具有相對廣泛的PAEs 底物譜。菌株YC-JY1在含有DBP、DPeP、DHP的TEM液體培養(yǎng)基中生長良好，并能夠很好地降解這些底物，說明菌株YC-JY1對具有中長側(cè)鏈的PAEs的降解能力要好于具有短側(cè)鏈和長側(cè)鏈的PAEs。

2.7 菌株YC-JY1降解DBP的代謝途徑推測

通過HPLC-MS分析，將質(zhì)譜圖所顯示的分子量，與標(biāo)準(zhǔn)化合物標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)（NIST，Gaithersburg，MD）庫數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。由于質(zhì)譜掃射選用的是負(fù)離子模式，所以圖11中的221.0所對應(yīng)的物質(zhì)應(yīng)是丟失一個氫離子的MBP，164.9對應(yīng)的物質(zhì)應(yīng)是丟失一個氫離子的PA。如圖12所示，推測菌株YC-JY1降解DBP的起始代謝途徑為：DBP通過水解反應(yīng)形成MBP，MBP進(jìn)一步水解形成PA。

圖11 DBP代謝產(chǎn)物HPLC-MS分析圖

圖12 DBP代謝途徑推測

3 討論

Xanthobactersp.是一類廣泛存在于自然環(huán)境中的革蘭氏陰性菌，已發(fā)現(xiàn)該屬的菌株具有降解多種污染物的能力。Xanthobactersp.有較多關(guān)于降解含鹵素的有機(jī)污染物的文章，Hosoda等［12］篩出的菌株XautotrophicusGJ10 和 Kevin McClay等［13］篩出的菌株XautotrophicusENV481都是能夠利用鹵化烴作為唯一的碳源和能源，對其進(jìn)行脫鹵作用。Petrus等［14］從土壤中分離出Xanthobacter autotrophicusPy2.，可以對汞和甲基汞進(jìn)行有效地降解。這些都表明，Xanthobactersp.在環(huán)境污染物的降解方面起到了重要作用。盡管來自不同環(huán)境的微生物降解PAEs的研究有很多，但是至今還沒有關(guān)于Xanthobactersp. 降解DBP的文獻(xiàn)。本文關(guān)于Xanthobactersp. 降解DBP 的報道，為Xanthobactersp. 降解有機(jī)污染物研究提供了參考。

細(xì)菌對PAEs的降解已有很多的研究，其中pH和溫度是影響菌株降解能力的重要因素，目前有關(guān)Xanthobactersp.降解最適條件已基本清楚。Schneider等［15］提出Xanthobacter autotrophicus.最適生長條件是 pH 6.8-7.2；Padden等［16］也發(fā)現(xiàn)，Xanthobacter aminoxidans最適pH 為7.2-7.9，在pH 6.5-8.5 也可以生長，這與上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基本一致。蒼白桿菌屬（Ochrobactrumsp.）降解DBP，pH 4.0-10.0 時，DBP的降解率在5%-100%。與之相比，菌株YC-JY1能在更廣泛的pH范圍內(nèi)降解DBP［17］。也有相關(guān)文章表明Xanthobactersp.生長和降解的最適溫度為28℃和32℃［18-19］，與本實(shí)驗(yàn)中菌株YC-JY1最適降解溫度30℃相符合。此外，在以前有關(guān)Xanthobactersp.的研究中，也未測過鹽度對其降解DBP的影響，而鹽度也是影響菌株降解能力的一個因素。本研究對Xanthobactersp.的耐鹽特征進(jìn)行了補(bǔ)充。

關(guān)于菌株對DBP的最大耐受濃度現(xiàn)已有很多報道。Herbert等［20］發(fā)現(xiàn)鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.）DEP-AD1通過20 d的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其可以在139 mg/L 的DBP中生長。而菌株YC-JY1在400 mg/L DBP中，3 d就可以看出明顯的生長。金雷等［21］篩出DBP降解菌株，類芽胞桿菌屬（Paenibacillussp.）S-3在5 d內(nèi)能夠?qū)?00 mg/L DBP降解82.7%，而菌株YC-JY1在5 d內(nèi)可以將100 mg/L DBP完全降解。與之相比，菌株YC-JY1對DBP具有更好的降解能力和耐受能力。

4 結(jié)論

本研究從長期受石油污染土壤中篩選出一株可以利用DBP作為唯一碳源的菌株，根據(jù)16S rDNA鑒定，確定其屬于黃色桿菌屬（Xanthobactersp.），并命名為YC-JY1。DBP降解的最優(yōu)條件是30℃，pH 7.0，不添加NaCl；菌株YC-JY1能夠高效降解100 mg/L-400 mg/L DBP，并具有相對廣泛的PAEs底物譜。5 d內(nèi)可以將100 mg/L DBP完全降解，對于100 mg/L DPeP和100 mg/L DHP可大部分降解；通過HPLC-MS分析，菌株YC-JY1降解DBP的中間代謝產(chǎn)物為MBP和PA，由此推測其起始代謝途徑為DBP水解為MBP，MBP進(jìn)一步水解為PA。