劉怡君 賈宇坤 王玲芳 劉虹杏 楊仙玉

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，臨安 311300）

內(nèi)皮分化相關(guān)因子-1（Endothelial differentiation related factor-1，EDF-1）最早是在HIV-1-Tat處理的人類內(nèi)皮細(xì)胞中分離的，具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用［1-2］，而腫瘤的生長和演進需要形成新血管來提供營養(yǎng)物質(zhì)，抑制腫瘤新血管的形成可以控制腫瘤的生長。

以蟾蜍（Bufo）為基源的蟾皮、蟾酥和蟾衣等，作為傳統(tǒng)中藥，具有解毒、抗菌、增強免疫力以及抗腫瘤等多種藥理作用［3-5］，廣泛應(yīng)用于多種疾病的臨床治療，包括腫瘤的治療［6-9］。由干蟾皮制成的水溶性注射液——華蟾素，具有良好的抗腫瘤效果，且已有實驗表明，其抗腫瘤的有效成分是多肽類物質(zhì)［10-13］。

作者所在團隊多年來從事蟾蜍皮膚相關(guān)功能性蛋白的基因克隆研究，以分析蟾蜍皮膚中含有的多肽類有效成分［13-17］。為能更好地挖掘蟾蜍皮膚的藥用價值和新藥開發(fā)潛能，作者嘗試將中華大蟾蜍（B. gargarizans）EDF-1開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［17］亞克隆至原核表達載體誘導(dǎo)其重組蛋白的表達，但是未能成功。因此本研究對中華大蟾蜍EDF-1的ORF進行了密碼子優(yōu)化，并委托公司合成和構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒。本文將報告通過密碼子優(yōu)化構(gòu)建中華大蟾蜍EDF-1原核表達載體的方法，重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化以及制備鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1的抗血清等的實驗結(jié)果，為后續(xù)研發(fā)抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的相關(guān)制劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 ICR小鼠和鼠飼料購于浙江省實驗動物中心，小鼠為40日齡健康的雌鼠。

1.1.2 實驗材料 大腸桿菌（E. coli）感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）、PVDF膜、Protein Maker、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（Kanamysin，Kan）、小鼠抗His-tag抗體和辣根過氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；X-tractor和BeyoGoldTMHis-tag Purification Resin（鈷膠）購自Clontech公司；基因合成委托蘇州金維智生物科技有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達載體的構(gòu)建 在前期工作中構(gòu)建的原核表達載體不能在宿主大腸桿菌順利表達，考慮可能因密碼子的偏好性，真核細(xì)胞的密碼子在原核細(xì)胞中存在識別困難。通過E. coliCodon Usage Analysis 2.1軟件進行密碼子的偏好性分析。根據(jù)上述結(jié)果，對方琦璐等［17］克隆的中華大蟾蜍EDF-1（GenBank 登錄號K F769459）的ORF委托公司進行密碼子優(yōu)化，化學(xué)合成，并連接到原核表達載體pET-28b，構(gòu)建密碼子優(yōu)化后的重組質(zhì)粒pET-28b-EDF-1-Bufo。

1.2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 將重組質(zhì)粒pET-28b-EDF-1-Bufo轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，涂布于LB固體培養(yǎng)基（含50 mg/L Kan），37℃倒置培養(yǎng)12-15 h。次日，取一單菌落接種于l mL LB培養(yǎng)液（含50 mg/L Kan），37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12-15 h。將過夜培養(yǎng)的菌液按l %的體積接種于LB培養(yǎng)液（含50 mg/L Kan），在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)至OD600值0.7-1.0時，加入IPTG使其終濃度分別為0、0.001、0.01、0.1、1 mmol/L，并在30℃和37℃分別進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達。每隔1 h收集一次菌液，通過離心收集菌體，加入1×SDS-PAGE上樣緩沖液裂解菌體并進行聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）以探索重組蛋白誘導(dǎo)表達的最佳條件。使用His-tag單克隆抗體進行Western-blot以確定過量表達蛋白為目的蛋白。

1.2.3 可溶性檢測及純化 按上述最佳條件，對重組中華大蟾蜍EDF-1進行大量誘導(dǎo)表達。在收集的0.5 mL 培養(yǎng)的菌體中加入 40 μL X-tractor、0.05 μL DNaseⅠ和0.5 μL 12 mg/mL溶菌酶使菌體徹底裂解，然后16 100×g離心20 min，將分離的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE。根據(jù)可溶性檢測結(jié)果，收集上清，按照鈷膠使用說明，取2 mL鈷膠（含1 mL儲存液）加入純化柱內(nèi)，用平衡液（pH 8.0）置換儲存液后，加入上清使其與鈷膠混合1 h，然后用2mmol/L 咪唑溶液（pH 8.0）洗滌5次，150 mmol/L咪唑溶液（pH 8.0）洗脫，純化的重組蛋白作為制備抗血清的抗原。

1.2.4 小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清的制備及其特異性和效價檢測 將純化的重組中華大蟾蜍EDF-1（蛋白濃度約1.5 μg/L）35 mL與弗氏完全佐劑1∶1混勻，在小鼠皮下多點注射；兩周后再與弗氏不完全佐劑1∶1混勻皮下注射，該步驟每周重復(fù)一次，共免疫4次。最后一次免疫一周后心臟采血，1 500×g離心30 min，上清即小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清?？寡宓奶禺愋酝ㄟ^Western-blot進行檢測。效價檢測使用間接ELISA，以純化的重組中華大蟾蜍EDF-1（2 μg/mL）為抗原，以小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1抗血清為一抗，抗血清從最低稀釋倍數(shù)1∶1000連續(xù)2倍比稀釋。顯色后，進行OD450檢測，若抗血清與陰性對照的比值（P/N）≥2.1，即判定為有效效價。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET-28b-EDF-1-Bufo的獲得

根據(jù)E. coliCodon Usage Analysis 2.1軟件分析結(jié)果（圖1）顯示中華大蟾蜍EDF-1有16%密碼子在大腸桿菌中使用頻率小于10%，存在識別困難的問題。委托公司優(yōu)化中華大蟾蜍EDF-1ORF 的密碼子并合成（圖2），連接至原核表達載體，最終構(gòu)建pET-28b-EDF-1-Bufo重組質(zhì)粒。

圖1 中華大蟾蜍EDF-1序列與大腸桿菌密碼子偏好性分析

2.2 重組中華大蟾蜍EDF-1誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coliBL21（DE3）后，使用不同的IPTG濃度、時間和溫度誘導(dǎo)重組中華大蟾蜍EDF-1的表達。SDS-PAGE結(jié)果（圖3）顯示，除對照組和IPTG濃度為0.001 mmol/L的樣品外，其他樣品均在20 kD附近出現(xiàn)明顯過量表達的蛋白，與預(yù)測的分子量19.662 kD非常接近，并且隨誘導(dǎo)時間的延長和IPTG濃度的增加表達量增加。為減少重組蛋白進入包涵體以及恒溫振蕩器的使用方便，選取37℃（實驗室常用）、0.01 mmol/L IPTG和誘導(dǎo)3 h作為最佳表達條件。

2.3 可溶性檢測

可溶性檢測（圖4）表明，重組中華大蟾蜍EDF-1蛋白主要分布于上清中，小部分分布于包涵體中。

2.4 重組目的蛋白的免疫印跡檢測

為確定過量表達重組蛋白是目的蛋白，使用His-tag抗體作為一抗實施Western-blot檢測。結(jié)果（圖5，泳道2和4）顯示，IPTG誘導(dǎo)的樣品在分子量20 kD附近出現(xiàn)明顯的信號，與SDS-PAGE結(jié)果吻合，表明該蛋白確實為目的蛋白。

圖2 中華大蟾蜍EDF-1優(yōu)化前和優(yōu)化后ORF堿基序列

圖3 重組中華大蟾蜍EDF-1在不同溫度、IPTG濃度、時間條件下的誘導(dǎo)表達

圖4 重組中華大蟾蜍EDF-1可溶性檢測

圖5 重組中華大蟾蜍EDF-1的Western-blot檢測

2.5 小鼠抗EDF-1-Bufo抗血清的特異性及其效價檢測

Western-blot檢測結(jié)果（圖6）顯示，小鼠抗重組中華大蟾蜍EDF-1的抗血清特異性良好。檢測OD450結(jié)果（表1）顯示，抗血清稀釋倍數(shù)達到1∶8 000時，P/N值為3.1，大于2.1，稀釋倍數(shù)達到1∶16 000時，P/N值為2.01，小于2.1，故該抗血清效價為1∶8 000。

圖6 重組中華大蟾蜍EDF-1以抗血清為一抗的Westernblot檢測

表1 EDF-1-Bufo ELISA檢測效價結(jié)果

3 討論

內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管內(nèi)表面的單層扁平上皮細(xì)胞，組成血管的內(nèi)壁。因此，無內(nèi)皮細(xì)胞的分化，就沒有新血管的形成。臨床與動物實驗證明，腫瘤的生長及演進也需要通過生成新血管為其提供所需營養(yǎng)［18］。沒有新生血管的營養(yǎng)供應(yīng)，腫瘤在直徑或厚度達到1-2 mm后將不再增大，因此抑制腫瘤血管生成的研究是當(dāng)前的研究熱點之一［19-20］。

EDF-1具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用，能夠阻斷新血管生成。EDF-1不僅在人類的內(nèi)皮細(xì)胞中分離得到［1］，在小鼠、壁虎中也克隆到該蛋白編碼的基因［2］。研究發(fā)現(xiàn)，血管的形成和血管完整性與一氧化氮（NO）在組織中的濃度息息相關(guān)，而EDF-1可以通過與細(xì)胞質(zhì)中的鈣調(diào)素結(jié)合，降低一氧化氮合成酶的活性，從而減少NO的含量［21-24］。又有研究發(fā)現(xiàn)，EDF-1與家蠶（Bombyx mori）的MBF-1（Multiprotein Bridging Factor-1）和盤基網(wǎng)柄菌（Dictyostelium discoideum）早期發(fā)育相關(guān)的H7高度同源，因此有人提出，EDF-1可能是轉(zhuǎn)錄激活因子，通過結(jié)合通用轉(zhuǎn)錄因子TBP（TATA Binding Protein）調(diào)節(jié)基因的表達，進而參與內(nèi)皮細(xì)胞分化的抑制，但此觀點有待進一步驗證［1，25-26］。

4 結(jié)論

本研究首次優(yōu)化中華大蟾蜍EDF-1ORF的密碼子，構(gòu)建其原核表達載體，明確重組中華大蟾蜍EDF-1原核表達的最佳條件，獲得特異性和效價優(yōu)良的小鼠抗中華大蟾蜍重組EDF-1的抗血清，為今后對EDF-1生理功能等進一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。

在中華大蟾蜍皮膚中EDF-1的發(fā)現(xiàn)揭示蟾蜍皮膚相關(guān)藥物中，EDF-1很可能是其中的多肽類有效成分之一。