陳婉琪 張鴻 王進峰 陳俊杰 林曉文 羅結華 許源陳艷芳 陸幸妍

（1. 廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣州 510006；2. 廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣州 510006；3. 廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州 510006）

冬凌草，學名碎米椏［Rabdosia rubescens（Hemsl.）Hara.］，唇形科香茶菜屬，具清熱解毒、消炎止痛、抗腫瘤等功效［1］。從冬凌草提取出的冬凌草甲素是貝殼杉烯二萜類有機化合物，已證實對多種腫瘤細胞有殺傷功效［2-3］，且無明顯毒副作用，目前已用于臨床抗腫瘤研究［4］。

毛狀根培養(yǎng)技術是20世紀80年代后期發(fā)展起來的植物組織培養(yǎng)新技術，是將發(fā)根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）的Ri質粒中T-DNA區(qū)（即轉移區(qū)）整合到植物細胞DNA組上，誘導出毛狀根并建立毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)［5］。植物毛狀根培養(yǎng)技術能有效改善植株生長緩慢、有效成分積累不足，以及某些植物在分化程度低時因缺乏階段調控而無法合成某些藥用次生代謝產物的局限性［5］，且不依賴外源植物激素、合成次生代謝產物能力較強且穩(wěn)定性好，尤其適用于發(fā)酵罐培養(yǎng)，故被認為是較好的獲得植物次生代謝產物的規(guī)?；稍牧希?］，可作為保障與提升重要藥用植物品質，應對中藥野生資源短缺及品質嚴重退化的有效途徑［7］。

本文報道冬凌草毛狀根的誘導培養(yǎng)及其提取物的抗腫瘤活性檢測，以期為利用毛狀根規(guī)模化生產冬凌草甲素藥物打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 冬凌草植株 濟源冬凌草，采自河南省濟源市王屋山，經廣東藥科大學中藥學院中藥學馬鴻雁副教授鑒定為真品，本實驗室無菌苗保種。

1.1.2 發(fā)根農桿菌菌株 發(fā)根農桿菌ATCC11325（廣東省微生物菌種保藏中心 編號：GMI1. 141）、發(fā)根農桿菌ATCC15834，由華南師范大學生命科學學院施和平教授惠贈，本實驗室保種。

1.1.3 癌細胞株 人肝癌細胞株BEL-7402、人肺癌細胞株A-549、人胃癌細胞株SGC-7901、人胃癌細胞株HGC均來自廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院實驗室。

1.1.4 主要試劑及儀器設備 Aladdin冬凌草甲素分析標準品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司 批號：H1616026 純度≥98%）、總DNA提取試劑盒（Magen公司）、1640 培養(yǎng)基（Gibco）、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco）、DMSO（Gibco，純度≥99%）、CCK-8試劑盒（南京建成生物工程研究所）、全自動酶標儀（Thermo Multiskan MK3，賽默飛世爾科技公司）、高效液相色譜儀（Dionex UltiMate 3000，戴安中國有限公司）、液相色譜柱（Kromasil 100-5-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）、甲醇（Labscience 純度：色譜純）等。

1.2 方法

1.2.1 冬凌草毛狀根的誘導及擴增培養(yǎng) 將活化后的發(fā)根農桿菌按1%接種量接種到含YEB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)30 h，菌液用于侵染。

取冬凌草無菌苗合適部位切成約1.0 cm2的外植體，置于預培養(yǎng)基（MS+0.2 mg/L NAA）中暗培養(yǎng)24 h后取出，放入MS液體培養(yǎng)基稀釋5倍的發(fā)根農桿菌菌液中分別浸泡10、20、30 min，取出吸干外植體表面多余的菌液，放回原預培養(yǎng)基中黑暗共培養(yǎng)。2 d后將外植體轉入含400 mg/L頭孢菌素的除菌生根培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)［8-9］。發(fā)根后將外植體上生長至2-3 cm的毛狀根與外植體分離，除菌培養(yǎng)后將其接種至無抗生素液體培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)。

1.2.2 毛狀根的PCR檢測 分別稱取適量冬凌草植株根系與新鮮的冬凌草不定根，提取樣品DNA。

rol B與rol C基因引物及其序列見表1［10］。PCR反應總體積為20 μL，擴增參數為：94℃預變性5min，94℃變性5 min，53.5℃退火復性5 min執(zhí)行37 循環(huán)，72℃延伸 45 s，72℃使延伸充分 10 min，4℃急冷。擴增后的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，用gel red染色進行分析。

表1 rol B與rol C基因引物及其序列

1.2.3 毛狀根的生長曲線繪制 參考《植物細胞工程》［11］，分別配制4種基本培養(yǎng)基：N6、B5、MS、1/2MS，121℃滅菌25 min，冷卻到室溫備用。

按0.5 g/100 mL接種量將長勢良好的毛狀根接種于蔗糖濃度為3%的B5培養(yǎng)基中，80 r/min，25℃暗培養(yǎng)，每隔10 d取樣一次，每次隨機取樣三瓶，將毛狀根清洗后置于55℃烘箱中烘干至恒重，測其干重，以每升培養(yǎng)液中毛狀根的干重繪制其生長曲線。

1.2.4 毛狀根的提取物制備及冬凌草甲素測定 精密稱取粉碎過60目篩的干粉10 g，加入12倍體積的95%乙醇超聲波提取3次，每次30 min，將提取液合并減壓旋蒸至乙醇揮干，得毛狀根粗提物。

以預處理后的大孔吸附樹脂濕法裝柱（柱長：10 cm，內徑：1.5 cm）。取毛狀根粗提物適量加甲醇溶解后，加少量大孔吸附樹脂拌勻，揮干溶劑，以1/6量于樹脂干法上樣，先水洗至無色，再用60%乙醇為洗脫劑，按15倍樹脂體積洗脫，蒸干流動相，得毛狀根提取物。

取毛狀根粗提物適量，加5 mL甲醇超聲溶解，過濾除菌，制成上樣液。

冬凌草甲素對照品溶液按中華人民共和國藥典（2010版）［14］制備。采用C-18反向硅膠柱（C185 μm，250 mm×4.6 mm），流動相甲醇-水為55：45（V/V），進樣量20 μL，1 mL/min恒速洗脫，檢測波長為239 nm。

分別取冬凌草甲素標準貯備液適量，用甲醇稀釋，制成質量濃度分別為50.8 μg/mL，60.96 μg/mL，121.92 μg/mL，203.2 μg/mL，508 μg/mL，812.8 μg/mL，1016 μg/mL的系列溶液；所得數據以冬凌草甲素的峰面積（A/AU）對濃度（C/μg）其進行線性回歸，得回歸方程為A=0.468C-0.398 4，（r=0.999 7）。結果表明，冬凌草甲素含量在50.8 μg/mL-1 016 μg/mL范圍內線性關系良好。

1.2.5 CCK-8法檢測毛狀根提取物對體外培養(yǎng)腫瘤細胞的增殖抑制 取冬凌草毛狀根提取物，加入DMSO超聲溶解后加入培養(yǎng)基調整提取物終濃度為0.5 mg/mL和1 mg/mL，且DMSO終濃度為0.4%，過濾除菌得試液。

分別取對數生長期的四種癌細胞株，按1×105個/mL的細胞濃度，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置CO2孵箱中，37℃培養(yǎng)24 h，細胞貼壁后棄去培養(yǎng)上清液，加入上述毛狀根提取物試液，每孔100 μL，6個復孔，同時設培養(yǎng)基空白對照孔，繼續(xù)培養(yǎng)40 h；后棄去含藥培養(yǎng)基，加入按10倍（V：V）稀釋的CCK-8檢測液，每孔110 μL，37℃孵育2 h后，測定各孔在450 nm處的吸光度值，按下列公式計算細胞抑制率。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS及OriginPro 8對實驗數據進行整理分析，多組比較采用單因素方差分析，結果以x-±SD表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 冬凌草毛狀根的誘導擴增

發(fā)根農桿菌ATCC11325和ATCC15834分別以10、20、30 min侵染冬凌草葉片、莖部和葉柄。其中ATCC11325侵染的外植體均未能誘導生根，而ATCC15834侵染外植體組，誘導培養(yǎng)5 d，于外植體葉柄和部分莖部切口處萌出白色帶絨毛的毛狀根（圖1-A）。待毛狀根長至2-3 cm，將其切離外植體進行除菌培養(yǎng)（如圖1-B），每周轉接1次，3-4次后即可完全除菌。當毛狀根長出明顯分叉，將其轉移至液體培養(yǎng)基中（圖1-C）。不定根呈白色、多纖毛，在無激素培養(yǎng)基上非向地性生長，經多次傳代，仍生長快速（圖1-D）。

圖1 發(fā)根農桿菌ATCC15834誘導冬凌草毛狀根

2.2 毛狀根的PCR檢測

電泳結果（圖2）顯示，冬凌草毛狀根總DNA的PCR產物中含有與ATCC15834的PCR產物中相同大小的條帶，而從冬凌草非轉化根的總DNA中擴增不到該條帶。

圖2 冬凌草毛狀根rol B和rol C基因的PCR擴增產物的凝膠電泳圖

2.3 培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)時間對冬凌草毛狀根生長速率的影響

冬凌草毛狀根在不同的基本培養(yǎng)基中增殖倍數分別是 B5＞1/2 MS＞MS＞N6，其中 B5 中毛狀根鮮重達到最大值（表2），N6中毛狀根基本不生長且褐化；B5、1/2 MS和MS中根的形態(tài)基本一致（圖3）。

表2 四種不同培養(yǎng)基對毛狀根的增殖倍數的影響

圖3 不同培養(yǎng)基液體培養(yǎng)的毛狀根

使用含3%蔗糖的B5培養(yǎng)基作為冬凌草毛狀根的擴增及冬凌草甲素合成的最適培養(yǎng)基對毛狀根進行培養(yǎng)，由圖4可見，毛狀根呈現“S”型增長，對數生長中期約為25 d，約70 d進入平臺期。

圖4 冬凌草毛狀根生長曲線

2.4 毛狀根中冬凌草甲素的測定

用HPLC法測定提取物中冬凌草甲素含量，結果顯示：與冬凌草甲素標準品（圖5-A）對比，毛狀根超聲粗提物（圖5-B）及大孔樹脂純化提取物（圖5-C）中均含有與冬凌草甲素標準品保留時間一致的成分，其含量分別約為0.017 1% 和 0.002 2%。

圖5 冬凌草甲素含量測定的HPLC圖

2.5 冬凌草毛狀根提取物抗腫瘤活性檢測

表3為不同濃度DMSO下人肝癌細胞BEL-7402的生長抑制率。與空白對照組相比，當DMSO≤0.4%，抑制率無顯著性差異。

表4為不同含量的毛狀根提取物對4種腫瘤細胞BEL-7402、A-549、SGC-7901、HGC的增殖抑制率。結果顯示，與陰性對照組（DMSO 0.4%）相比，毛狀根提取物濃度高于1 mg/mL時，對四種腫瘤細胞的抑制率達95%以上。

表3 不同濃度DMSO對人肝癌細胞BEL-7402生長的影響

表4 毛狀根提取物對人肝癌細胞BEL-7402、人肺癌細胞株A-549、人胃癌細胞株SGC-7901和人胃癌細胞株HGC的抑制率

3 討論

毛狀根的誘導狀況與發(fā)根農桿菌的種類、菌液濃度、外植體來源及大小誘導部位的選擇、誘導條件等有關［15-16］。發(fā)根農桿菌對外植體的發(fā)根誘導有一定的選擇性，不同發(fā)根農桿菌的致病力不同［17］。本實驗用發(fā)根農桿菌ATCC11325和ATCC15834分別誘導冬凌草毛狀根，結果發(fā)現，ATCC11325侵染不同部位的外植體均無法成功誘導冬凌草毛狀根。推測原因為不同發(fā)根農桿菌的致根能力有一定特異性，與其所攜帶Ri質粒類型［18］和受體植物的種類有關［19］。此外，也不排除由于ATCC11325比ATCC15834對冬凌草外植體細胞的損傷更大導致其無法增殖和誘根。用ATCC15834感染外植體并暗培養(yǎng)5 d左右，大部分不定根均從葉柄及莖部的切口處萌發(fā)，而葉片表面未發(fā)現不定根，這可能是植株中處于形態(tài)學下端的部位一般生長素含量較高，故葉柄及莖部的毛狀根萌發(fā)率較葉片高，且適量生長素可使誘導毛狀根生成的ro1 B、ro1 C基因的表達增強［20］；也可能是不同部位的外植體分化能力不同，一般分化能力強的外植體由于處于轉化的敏感期，其誘導分化能力較高［21］。

影響毛狀根增殖速度的因素有很多，不同植物種類有不同的最適培養(yǎng)基，在由不同組成成分的液體培養(yǎng)基中毛狀根增殖的速度存有一定的差異，其他培養(yǎng)條件對毛狀根生長及其次生代謝物質的積累也有很大的影響［22-23］。本實驗中將冬凌草毛狀根接種到4種液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實驗結果表明毛狀根在B5培養(yǎng)基中增殖倍數最高，培養(yǎng)45 d后增殖倍數為31.4倍，其次是1/2 MS和MS培養(yǎng)基，N6最差，幾乎沒有增殖。本研究通過考察不同因素對冬凌草毛狀根的誘導、生長及其中冬凌草甲素生物合成的影響，確定含3%蔗糖的B5培養(yǎng)基為冬凌草毛狀根的擴增及冬凌草甲素合成的最適培養(yǎng)基。

本實驗測定了毛狀根生長曲線呈現“S”型，1-10 d新接種的毛狀根適應培養(yǎng)環(huán)境，為毛狀根的生長遲緩期；10-45 d毛狀根快速生長，其中25 d 左右為對數中期，期間冬凌草毛狀根生長迅速，培養(yǎng)基變?yōu)槌吻宓狞S色液體，推測可能合成一些分泌類物質；55 d 后毛狀根生長變緩，且部分褐化，培養(yǎng)基色澤漸濃，可能是營養(yǎng)成分不足和生長空間擠壓所致；70 d 后進入平臺期，該期的毛狀根鮮重少量增加，干重基本穩(wěn)定，培養(yǎng)基顏色變濃，呈褐色。因此，處在對數期的冬凌草毛狀根生長速度快，故可以選擇25 d左右進行毛狀根的繼代培養(yǎng)。

發(fā)根農桿菌侵染植物傷口后將其Ri質粒的T-DNA區(qū)DNA片段插入整合至植物細胞基因組，促使植物傷口處產生不定根，其中可表達部分的植物基因，如多糖類物質及次生代謝產物等，其中不乏抗癌有效成分。采用高效液相色譜法測定冬凌草甲素含量，結果顯示，與冬凌草甲素標準品對比，毛狀根超聲粗提取物及毛狀根大孔樹脂純化提取物中均含有與冬凌草甲素標準品保留時間一致的成分。DMSO作為助溶劑廣泛用于藥物干預性實驗。據文獻報道，當DMSO含量低于1%，對人肝癌、食管癌、宮頸癌及神經母細胞瘤細胞生長與繁殖均無影響［24］。本研究結果顯示，當DMSO≤0.4%，對腫瘤細胞不顯示非特異性毒性，與文獻報道基本相符。此外，當毛狀根提取物濃度為1 mg/mL時，對4種癌細胞株的生長抑制率達95%以上。基于HPLC法檢測出毛狀根提取物中含有冬凌草甲素，而冬凌草甲素為冬凌草抗腫瘤藥用組分已被證實［2-3］，故初步推斷，冬凌草毛狀根提取物抗腫瘤活性關鍵成分為冬凌草甲素。

4 結論

本研究首次成功誘導了冬凌草毛狀根，證實了該毛狀根中含有冬凌草甲素，且該毛狀根提取物具有抑制腫瘤細胞增殖活性，為后續(xù)開展冬凌草毛狀根冬凌草甲素應用研究及冬凌草遺傳性狀的改造奠定技術基礎。