李玉聰 李濱影 油心怡 劉宇豪 周波 林榕姍，2

（1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，泰安 271018；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

馬鈴薯是世界第四大糧食作物，在全球各地均有廣泛栽培，我國(guó)是世界最大的馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)。馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯的主要病害之一，近年來(lái)在我國(guó)各馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生。該病可由多種鏈霉菌引起，主要包括Streptomyces scabies、S. acidiscabies和S.turgidiscabies等［1］，并且不斷有新的病原鏈霉菌被報(bào)道［2-4］。感病馬鈴薯塊莖表面形成凸起狀、凹陷狀或平狀的病斑，病斑區(qū)域的細(xì)胞木栓化，呈痂狀［5］。馬鈴薯瘡痂病可影響薯塊的外觀和品質(zhì)，降低其商品價(jià)值［6-7］，病情嚴(yán)重時(shí)影響馬鈴薯出苗，導(dǎo)致減產(chǎn)［8］，給我國(guó)的馬鈴薯生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)于該病還缺少很好的防治方法，而探索有效的生物防治方法正逐漸引起人們的重視。本研究以馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標(biāo)菌株，從山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤中分離篩選對(duì)馬鈴薯瘡痂病有拮抗作用的菌種，通過(guò)菌體形態(tài)觀察、革蘭氏染色、生理生化測(cè)定及16S rDNA基因序列分析對(duì)一株拮抗能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行盆栽防病效果測(cè)定，旨在為馬鈴薯瘡痂病的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸膏5.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 7.0-7.4。LB固體培養(yǎng)基：每1 000 mL LB液體培養(yǎng)基加入瓊脂20.0 g。高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01 g、瓊脂 20.0 g、水 1 000 mL，pH 7.2-7.4。燕麥瓊脂培養(yǎng)基：燕麥片20.0 g加入水中煮沸約20 min，經(jīng)紗布過(guò)濾，加水定容至1 000 mL，加入瓊脂20.0 g，pH 7.2。檸檬酸鹽培養(yǎng)基：檸檬酸鈉 2.0 g、K2HPO41.0 g、NH4H2PO41.0 g、NaCl 5.0 g、MgSO40.2 g、瓊脂20.0 g、1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液10.0 mL，pH 6.8。阿拉伯糖培養(yǎng)基：胰蛋白胨2.7 g、NaCl 5.0 g、K2HPO40.3 g、1%溴麝香草酚藍(lán)水溶液3.0 mL、瓊脂5.0 g、水1 000 mL，pH 7.0。木糖-明膠培養(yǎng)基：0.2%酚紅溶液25 mL、明膠120 g、水1 000 mL，pH 7.6。以上培養(yǎng)基于121℃滅菌30 min后使用。

1.1.2 供試菌株 馬鈴薯瘡痂病病原菌：Streptomyces bottropensisAMCC400023，來(lái)源于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 土壤樣品 土壤樣品采集于山東省高密市李家營(yíng)鎮(zhèn)、孟家莊、張家莊、城律村、祝家莊的馬鈴薯瘡痂病病發(fā)地。采集時(shí)除去發(fā)病地塊表層5 cm土壤，取5-15 cm深層土壤，每份樣品10 g。

1.1.4 供試馬鈴薯 拮抗菌的盆栽防效測(cè)定試驗(yàn)中所用馬鈴薯品種為荷蘭15號(hào)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌孢子懸液的制備 將馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023接種于燕麥瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-5 d。用無(wú)菌水沖洗下孢子，轉(zhuǎn)入100 mL離心管中，4℃、8 000 r/min離心20 min，棄上清，用20%的甘油液重懸孢子，分裝于2 mL離心管中，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌的分離與初篩 取1.0 g土壤樣品加入99 mL無(wú)菌水，37℃、180 r/min充分振蕩30 min，后80℃水浴20 min。取適量土壤懸濁液梯度稀釋后涂布于LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落，純化，接種至LB培養(yǎng)基斜面，37℃培養(yǎng)24 h，菌種于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。采用平板?duì)峙生長(zhǎng)法進(jìn)行拮抗菌的初篩。取100 μL病原菌孢子懸液涂布于高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基平板，并將已活化的待篩選菌種點(diǎn)接至培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)3-5 d，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈，比較抑菌圈的大小，選擇抑菌圈較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

1.2.3 拮抗菌的復(fù)篩 采用牛津杯法進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。將純化后的待篩選拮抗菌分別接入等量LB液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)好的菌液12 000r/min離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾除去菌體，制得拮抗菌的無(wú)菌上清液。吸取適量無(wú)菌上清液涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，將3個(gè)無(wú)菌牛津杯置于培養(yǎng)基上，使3個(gè)牛津杯圍繞培養(yǎng)基中心點(diǎn)呈三角形。在其中兩個(gè)牛津杯中各加入200 μL無(wú)菌上清液，另一個(gè)牛津杯加入等體積的無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。28℃培養(yǎng)5-7 d后查看結(jié)果，對(duì)有拮抗效果的菌株使用游標(biāo)卡尺通過(guò)十字交叉法測(cè)量并記錄其抑菌圈直徑，根據(jù)抑菌圈直徑大小衡量各菌株的拮抗能力，并重復(fù)3次復(fù)篩試驗(yàn)以確認(rèn)結(jié)果。選擇一株拮抗能力優(yōu)良的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察 將拮抗菌接種于LB培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)特征（包括形態(tài)、大小、顏色、邊緣、表面、透明度等），并對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色并油鏡鏡檢。

1.2.5 生理生化測(cè)定 參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》［9］和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［10］的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)拮抗菌的接觸酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用、阿拉伯糖利用、木糖利用以及耐鹽性等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 16S rDNA 基因序列分析 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA。選用16S rDNA通用引物（27F/1 492R）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物（27F）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′， 反 向引 物（1 492R）：5′-CTACGGCTACCTTGTTACA-3′。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：DNA模板2 μL10×PCR buffer 2.5 μL，正向引物（27F）0.5 μL，反向引物（1492R）0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.25 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 補(bǔ) 足 25 μL。PCR 結(jié) 束 后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送交鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將菌株的16S rDNA基因序列與NCBI已知的核酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得相近屬種菌株的相應(yīng)基因序列，使用Clustal X、MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7 拮抗菌對(duì)馬鈴薯瘡痂病的盆栽防效測(cè)定 選取健康的荷蘭15號(hào)馬鈴薯，用75%乙醇對(duì)其表面消毒，清水洗凈，置于28℃光照培養(yǎng)箱中催芽。待出芽后取出，將馬鈴薯切成留有一個(gè)芽眼的三角塊，選取芽長(zhǎng)相近的薯塊置于濾紙上晾1 d（若馬鈴薯較小則直接栽種）。然后將薯塊芽眼朝上，播至混配蛭石和土壤（1∶1）的花盆中，于田間種植培養(yǎng)。

其中CK表示僅澆清水；SB表示鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensis發(fā)酵液；BM（單）表示拮抗菌Bacillus methylotrophicus發(fā)酵液一次澆灌；BM（雙）表示拮抗菌Bacillus methylotrophicus發(fā)酵液兩次澆灌。分別制備病原菌與拮抗菌的發(fā)酵液（108CFU/mL），在馬鈴薯新生薯塊剛剛形成時(shí)采取灌根法接種病原菌孢子懸液，每盆100 mL；在接種后的第7、14和21 d別接入100 mL拮抗菌的孢子懸液，并設(shè)僅澆灌清水對(duì)照、僅接種病原菌對(duì)照以及接種病原菌并澆灌LB液體培養(yǎng)基對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

待馬鈴薯收獲后，進(jìn)行病害分級(jí)鑒定，計(jì)算病情指數(shù)與防治效果。馬鈴薯瘡痂病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及統(tǒng)計(jì)方法病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［11］為：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，有病斑1%-5%；2級(jí)，有病斑5%-10%；3級(jí)，有病斑10%-20%；4級(jí)，有病斑20%-40%；5級(jí)，有病斑40%-60%；6級(jí)，病斑60%以上。發(fā)病率=發(fā)病粒數(shù)/收獲小薯粒數(shù)×100%，病情指數(shù)=∑（病級(jí)粒數(shù)×發(fā)病級(jí)別）/（收獲小薯粒數(shù)×最高級(jí)別）×100%，防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/照病情指數(shù)×100%［11］。使用R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的拮抗效果

初篩得到15株拮抗效果較好的菌株，并從其中挑選了9株菌進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。復(fù)篩試驗(yàn)中各菌株的發(fā)酵液液所產(chǎn)生的抑菌圈直徑如表1所示，說(shuō)明各菌株的發(fā)酵液中可能含有多種抑菌活性物質(zhì)，對(duì)馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023均具有一定拮抗作用。其中菌株1-3-4的抑菌圈直徑為20.74 mm，對(duì)病原菌的拮抗能力最強(qiáng)（圖1）。

表1 各菌株發(fā)酵液產(chǎn)生的抑菌圈直徑

圖1 菌株1-3-4拮抗菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的拮抗效果

2.2 菌株1-3-4的菌體形態(tài)觀察

經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h后，菌株1-3-4的菌落在LB培養(yǎng)基平板上呈圓形，乳白色，略有隆起，表面褶皺干燥，不透明，邊緣不整齊，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，菌體桿狀（圖2）。

圖2 菌株1-3-4在LB培養(yǎng)基平板上的菌落形態(tài)（左）與革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果（右）

2.3 菌株1-3-4生理生化測(cè)定結(jié)果

菌株1-3-4的生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。菌株1-3-4的接觸酶實(shí)驗(yàn)反應(yīng)呈陽(yáng)性，V-P測(cè)定反應(yīng)呈陰性，能夠分解利用檸檬酸鹽、阿拉伯糖、木糖，對(duì)2%、5%、7%和10%鹽濃度具有耐受性。

表2 菌株1-3-4的生理生化特性

2.4 菌株1-3-4 16S rDNA基因序列分析結(jié)果

以菌株1-3-4的DNA為模板，PCR擴(kuò)增得到該菌株約1.4 kb的特異性片段。經(jīng)測(cè)序后，用MEGA 7構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。根據(jù)菌株1-3-4的16S rDNA基因序列分析結(jié)果，結(jié)合其培養(yǎng)形態(tài)特征和生理生化特性，將該菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.5 菌株1-3-4對(duì)馬鈴薯瘡痂病盆栽防效測(cè)定結(jié)果

通過(guò)溫室盆栽試驗(yàn)測(cè)定了菌株1-3-4對(duì)馬鈴薯瘡痂病的防治效果。結(jié)果（圖4）顯示接種瘡痂病病原菌的薯塊發(fā)病情況較為嚴(yán)重，菌株1-3-4在盆栽試驗(yàn)中防治效果約為40.27%與48.66%（表3），顯著降低了馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病程度。說(shuō)明菌株1-3-4對(duì)于馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用。

圖3 基于菌株1-3-4 16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

表3 菌株1-3-4對(duì)馬鈴薯瘡痂病的盆栽防治效果

圖4 馬鈴薯瘡痂病拮抗菌盆栽防效試驗(yàn)

3 討論

馬鈴薯瘡痂病是一種較難防治的農(nóng)業(yè)病害，隨著馬鈴薯種植的不斷推廣，其為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)的危害也逐漸加重。傳統(tǒng)的應(yīng)對(duì)方法是采用多種化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但化學(xué)防治存在著誘發(fā)微生物抗藥性、毒害農(nóng)作物、環(huán)境污染等問(wèn)題［12］。而利用拮抗菌進(jìn)行生物防治具有防病效果好、綠色無(wú)污染、對(duì)生態(tài)環(huán)境影響較小等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸引起人們的重視。劉大群等［13］報(bào)道了利用拮抗鏈霉菌防治馬鈴薯瘡痂病的大田試驗(yàn)研究，不同接種量和接種方法均顯著地影響防治效果。Hiltunen等［14］利用淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌（S. diastatochromogenes）PonSSII等非致病性鏈霉菌防治馬鈴薯瘡痂病，田間試驗(yàn)結(jié)果表明防治效果較好。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)針對(duì)馬鈴薯瘡痂病進(jìn)行生物防治研究時(shí)采用的病原菌多為S. scabies、S. acidiscabies和S. turgidiscabies等菌株［11］，而對(duì)于Streptomyces bottropensis病原菌防治方面的報(bào)道較少。本研究以馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標(biāo)菌株，從山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤中分離篩選得到了1株對(duì)馬鈴薯瘡痂病病原菌具有較強(qiáng)有拮抗作用的菌株1-3-4，其抑菌圈直徑達(dá)19.74 mm。根據(jù)該菌株的16S rDNA基因序列分析結(jié)果，結(jié)合其培養(yǎng)形態(tài)特征和生理生化特性，將其鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

近年來(lái)關(guān)于該類菌株應(yīng)用于植物病害生物防治的報(bào)道較多。劉利強(qiáng)等［17］通過(guò)田間藥效試驗(yàn)確定了30億個(gè)/g甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌可濕性粉劑的對(duì)于防治黃瓜灰霉病的最佳使用劑量。謝學(xué)文等［18］從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到1株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌WF-3，田間試驗(yàn)表明其對(duì)黃瓜炭疽病具有良好的防治效果。周登博等［19］分離得到一株甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16，其對(duì)香蕉枯萎病在內(nèi)的9種病原菌真菌具有廣譜抑菌活性。目前國(guó)內(nèi)外還少有關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌用于防治馬鈴薯瘡痂病的報(bào)道。本研究拓展了甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的應(yīng)用范圍，為新型微生物制劑的開發(fā)提供了良好資源。

為了初步探明該菌株對(duì)馬鈴薯瘡痂病的實(shí)際防治效果，進(jìn)行了盆栽防效測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果顯示菌株1-3-4可顯著降低馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病程度，防治效果約為40.27%與48.66%，具有良好的應(yīng)用前景。而該菌株在實(shí)際生物防治過(guò)程中的最佳施用方法、施用濃度、在土壤及馬鈴薯植株內(nèi)的定殖情況以及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響等還需要進(jìn)一步的研究以明確。

4 結(jié)論

以山東省高密市馬鈴薯種植地采集的土壤為研究對(duì)象，馬鈴薯瘡痂病病原菌Streptomyces bottropensisAMCC400023為靶標(biāo)菌，篩選獲得較強(qiáng)有拮抗作用的菌種1-3-4，將其鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。盆栽防效測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株1-3-4對(duì)于馬鈴薯瘡痂病具有較好的防治作用。