高慶龍 陳升寶 田文佳 張學(xué)銘 馬玉超

（1北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2 北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

PHA（Polyhydroxyalkanoates，聚羥基脂肪酸酯）是一種高值生物聚合物，可作為生物塑料或粘合劑［1］，可被分解轉(zhuǎn)化成藥物或手性化合物的中間體［2］，也可經(jīng)甲酯化后作為生物柴油［3］。中長(zhǎng)鏈PHA的生產(chǎn)一般采用葡萄糖、有機(jī)酸或烷烴等作為碳源和能源，采用脈動(dòng)給料法和分批給料法等生產(chǎn)工藝發(fā)酵生產(chǎn)PHA。該法雖PHA產(chǎn)量高，但是碳源底物增加了生產(chǎn)成本，限制了PHA的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。利用來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的木質(zhì)素生物合成PHA是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，更是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。

木質(zhì)素是木質(zhì)纖維素的主要成分之一，約占自然界中木質(zhì)纖維素干重的15%-30%，是僅次于纖維素的可再生生物質(zhì)資源，也是含量最為豐富的芳香族類聚合物。木質(zhì)素由3種苯丙烷單體通過(guò)C-O、C-C等化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的化學(xué)鍵連接構(gòu)成［4］，很難被分解利用，經(jīng)常作為廢棄物燃燒產(chǎn)熱，造成了極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染［5-8］。目前有很多關(guān)于木質(zhì)素高溫降解和化學(xué)催化降解方面的報(bào)道［9-10］，但是所獲得的產(chǎn)物是混合物，使木質(zhì)素的高值化利用成為了一個(gè)挑戰(zhàn)。木質(zhì)素的生物轉(zhuǎn)化涉及多個(gè)步驟，主要包括木質(zhì)素解聚，芳香族化合物利用和代謝產(chǎn)物形成等過(guò)程。每一步都需要多種酶的參與。細(xì)菌具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性、強(qiáng)大的產(chǎn)物積累能力、相對(duì)較短的生長(zhǎng)周期、以及較成熟的遺傳操作系統(tǒng)等，在木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化方面具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。但是，細(xì)菌的木質(zhì)素降解能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于白腐真菌［11-12］，而且系統(tǒng)研究細(xì)菌木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的研究相對(duì)較少［13-14］。因此，對(duì)木質(zhì)素降解細(xì)菌進(jìn)行代謝工程改造，使菌株合成有價(jià)值的化學(xué)品或其他高值化合物，將為木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化途徑的系統(tǒng)性研究和全局調(diào)控提供研技術(shù)基礎(chǔ)和研究思路［15］。

在限制氮源的條件下，P. putidaKT2440可利用木質(zhì)素合成PHA［8，14］。在細(xì)菌中，hsdR基因一般編碼限制-修飾系統(tǒng)中I型限制酶EcoK或EcoB的一個(gè)亞基。宿主的限制-修飾現(xiàn)象能辨別自身的DNA與外源DNA，并能使后者降解掉。為了便于對(duì)P.putidaKT2440進(jìn)行遺傳操作，前期我們通過(guò)同源重組構(gòu)建了hsdR基因缺失突變株P(guān). putidaQSR1。本文以QSR1為出發(fā)菌株，采用代謝工程的方法，強(qiáng)化該菌株利用木質(zhì)素積累PHA的能力，旨在探索提高木質(zhì)素轉(zhuǎn)化效率的方法，為PHA的高效、低成本生產(chǎn)提供研究思路。

表1 實(shí)驗(yàn)多用的質(zhì)粒和菌株

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 相關(guān)菌株、質(zhì)粒與試劑 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒和菌株見(jiàn)表1。用于構(gòu)建載體的引物由Invitrogen公司合成，DNA Ladder、限制性內(nèi)切酶、高保真DNA聚合酶Mix、T4 DNA連接酶、PCR純化和膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biomega公司，細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司。玉米芯木質(zhì)素由山東龍力生物科技有限公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl；S.O.C培養(yǎng)基：20 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 mmol/L NaCl，2.5mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L MgSO4；10×M9溶 液 ：6.78 g/L Na2HPO4（15.138 g/L Na2HPO4·12H2O）、3 g/L KH2PO4、0.5 g/L NaCl；微量 元 素 液：CuSO4、MnSO4、FeSO4、ZnSO4各 100 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 pK18PHAC1C2質(zhì)粒的構(gòu)建 首先，利用引物對(duì)PHAC1-F/R和PHAC2-F/R分別從P. putidaKT2440基因組中擴(kuò)增phaZ基因的上游phaC1（1 772 bp）和下游phaC2（1 824 bp）DNA片段。接著，先將純化后的phaC1片段經(jīng)酶切、連接插入pUC18載體的Hind Ⅲ/XbaⅠ克隆位點(diǎn)，獲得載體pUCPHAC1；再將phaC2片段插入pUCPHAC1的KpnⅠ/XbaⅠ位點(diǎn)，獲得載體pUCPHAC1C2。然后，以pUCPHAC1C2為模板，利用引物對(duì)PHAC1-FH/PHAC2-RB擴(kuò)增phaC1C2DNA片段，并將該片段插入pK18mobsacB載體的HindⅢ/BamH Ⅰ位點(diǎn)，構(gòu)建pK18PHAC1C2載體。

1.2.2 pVLTPHAZ質(zhì)粒的構(gòu)建 以PHAZ-FK/RH為引物，利用高保真DNA聚合酶從KT2440基因組中PCR擴(kuò)增獲得phaZ基因的編碼區(qū)序列；該基因經(jīng)純化、酶切和連接插入pVLT33質(zhì)粒的KpnI/Hind III位點(diǎn)，獲得重組載體pVLTPHAZ。

1.2.3 pVLTDYPB質(zhì)粒的構(gòu)建 以dypB-FK/RH為引物，利用高保真DNA聚合酶從R. jostiiRHA1基因組［16］中擴(kuò)增獲得dypB基因。之后，通過(guò)酶切和連接將純化后dypB基因片段分別插入pVLT33的KpnI/Hind III位點(diǎn)，獲得重組載體pVLTpelBDYPB。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.4 突變株的構(gòu)建和篩選 采用電轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入E. coliS17-1及P. putidaQSRZ6；采用雙親接合法［17］將重組載體pK18PHAC1C2導(dǎo)入P.putidaQSR1。利用20%蔗糖篩選同源重組雙交換突變株；篩選過(guò)程中卡那霉素的使用濃度為50 μg/mL，氨芐青霉素的使用濃度為50 μg/mL；利用相應(yīng)引物的菌落PCR法驗(yàn)證各步驟的突變株。

1.2.5 過(guò)氧化物酶酶活的測(cè)定 通過(guò)ABTS的氧化速率（?420=36 mmol·L-1·cm-1）來(lái)測(cè)定DypB的活性。1 mL的反應(yīng)體系中含有50 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 4.5），0.5 mmol/L H2O2，2.5 mmol/L ABTS 以及400 μL粗酶液（上清液）。使用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)420 nm條件下1分鐘內(nèi)體系中吸光度的增加量。以每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位U。

1.2.6 PHA提取和定量 以含有2 mL 1 mol/L MgSO4、1 mL 1 mol/L MnSO4、100 μL 1 mol/L CaCl2和1 mL微量元素溶液的1×M9為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH7.0），分別添加10 g/L葡萄糖和10 g/L玉米芯木質(zhì)素作為碳源和能源積累PHA。挑取平板上活化的單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)；接著將菌液加入到四倍體積的新鮮的LB培養(yǎng)基中，再培養(yǎng)2 h以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；然后按照5%的接種量將其接種到100 mL產(chǎn)PHA培養(yǎng)基中；30℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)過(guò)程中的0 h，6 h，12 h，24 h，48 h取樣測(cè)量菌體的生長(zhǎng)情況和PHA的積累情況。PHA的提取與定量參照Lu等［15］的方法。

2 結(jié)果

2.1 基因突變株的構(gòu)建

2.1.1 ?phaZ突變株的構(gòu)建 使用酶切連接的方法將phaZ基因上游phaC1片段和下游phaC2片段進(jìn)行連接，并插入到pK18mobsacB中，構(gòu)建phaZ敲除質(zhì)粒pK18PHAC1C2。然后，通過(guò)雙親接合法將pK18PHAC1C2導(dǎo)入hsdR基因缺失突變株P(guān). putidaQSR1，再通過(guò)抗生素和蔗糖篩選獲得phaZ基因失活突變株P(guān). putidaQSRZ6（簡(jiǎn)稱QSRZ6），并且利用引物對(duì)PHA-F/R（表2）進(jìn)行PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證引物PHA-F/R分別位于敲除片段上下游同源臂上，若phaZ被成功敲除，驗(yàn)證引物所擴(kuò)增的條帶應(yīng)為626 bp，若未敲除成功，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 426 bp（圖1-A）。

為了驗(yàn)證phaZ缺失突變株的功能，我們構(gòu)建了phaZ的功能互補(bǔ)菌株。pVLT33為廣宿主表達(dá)載體，含有一個(gè)lacqI-tac啟動(dòng)子。我們將phaZ基因（852 bp）插入該載體，利用引物對(duì)pVLT33-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證該質(zhì)粒正確后（圖1-B，驗(yàn)證中引入了pVLT33上約200 bp序列），將其導(dǎo)入突變株QSRZ6獲得P. putidaQSRZ6 - pVLTPHAZ（后簡(jiǎn)稱PVLTPHAZ）。

2.1.2 DypB強(qiáng)化表達(dá)菌株的構(gòu)建 來(lái)源于可降解木質(zhì)素R. jostiiRHA1的DypB蛋白是木質(zhì)素降解酶，屬于過(guò)氧化物酶類［18］。DypB屬于胞外酶，需要一段前導(dǎo)肽序列以協(xié)助其穿過(guò)細(xì)胞膜。通過(guò)SignalP4.1軟件分析，發(fā)現(xiàn)DypB序列前端不存在前導(dǎo)肽序列。在擴(kuò)增DypB編碼基因時(shí)，通過(guò)引物在DypB的N端引入了編碼軟腐歐文氏菌PelB的前導(dǎo)肽序列（序列詳見(jiàn)表2中dypB-F中雙下滑線）。我們將pelBdypB基因片段分別插入載體pVLT33中，經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證（圖1-C），得到重組質(zhì)粒pVLTpelBDYPB，又利用電轉(zhuǎn)化法將這重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入phaZ缺失突變株QSRZ6中，得到P. putidaQSRZ6B（簡(jiǎn)稱QSRZ6B）。

圖1 各基因突變株的驗(yàn)證

2.2 phaZ基因缺失突變株的PHA積累能力

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是原核微生物在碳氮比失衡的情況下，作為碳源儲(chǔ)藏物的一種聚酯類物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。PhaZ具有mcl-PHA解聚功能，本研究構(gòu)建了phaZ基因缺失突變株（QSRZ6）和phaZ的功能互補(bǔ)菌株（PVLTPHAZ）。以P.putidaQSR1為對(duì)照，研究了phaZ基因和對(duì)菌體生長(zhǎng)和細(xì)胞積累PHA的能力的影響。

以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)過(guò)程中，QSR1在24 h時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期；功能互補(bǔ)菌株經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間的延遲期，較其他兩株菌生長(zhǎng)緩慢；與QSR1相比，QSRZ6對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，48 h時(shí)還在繼續(xù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)量明顯增加，OD600達(dá)到0.55，提高了29%（圖2-A）。提取培養(yǎng)48 h的胞內(nèi)PHA，發(fā)現(xiàn)出發(fā)菌株QSR1的PHA產(chǎn)量為131 mg/L，由于過(guò)量表達(dá)PhaZ分解利用了部分PHA，功能互補(bǔ)菌株P(guān)VLTPHAZ產(chǎn)量?jī)H為63 mg/L，而phaZ基因敲除突變株QSRZ6的PHA產(chǎn)量為236 mg/L，是出發(fā)菌株的1.8倍（圖2-B）。

在使用木質(zhì)素為碳源時(shí)，由于木質(zhì)素溶于培養(yǎng)基后使培養(yǎng)基顏色較深，若使用OD600不能很好表征生長(zhǎng)量，所以我們選用菌落形成單位來(lái)表征菌株生長(zhǎng)情況。從圖2-C中可看出，功能互補(bǔ)菌株的菌落形成單位（CFU/mL）明顯低于菌株QSR1和敲除突變株QSRZ6，而QSRZ6和QSR1的生長(zhǎng)情況基本一致。QSR1、QSRZ6和PVLTPHAZ的PHA產(chǎn)量分別為44 mg/L、124 mg/L和31 mg/L。QSRZ6的PHA產(chǎn)量最高，是出發(fā)株的2.8倍（圖2-D），說(shuō)明敲除phaZ基因?qū)SR1利用木質(zhì)纖維素積累PHA有顯著的提升。

2.3 P. putida QSRZ6B的PHA積累能力

在phaZ基因失活的基礎(chǔ)上，我們強(qiáng)化表達(dá)了R.jostiiRHA1的DypB。利用木質(zhì)素為唯一碳源和能源發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)氧化物酶強(qiáng)化表達(dá)菌株時(shí)，與轉(zhuǎn)入空載體pVLT33的菌株P(guān). putidaQSRZ6-pVLT33相比，在48 h時(shí)QSRZ6B的菌落形成單位均提高了133%，菌體干重也提高146%。取24 h和36 h的樣品測(cè)定過(guò)氧化物酶活性，對(duì)照菌株自身存在過(guò)氧化物酶活性，但酶活在不同時(shí)段均處于較低水平；QSRZ6B的酶活分別為0.11 U/mL和0.23 U/mL。發(fā)酵48 h，QSRZ6B的PHA積累量為140 mg/L，較QSRZ6和QSR1分別提高了13%和218%（圖3）。上述結(jié)果表明，強(qiáng)化表達(dá)R. jostiiRHA1的DypB提高了菌株降解和利用木質(zhì)素的水平，使QSRZ6B的生長(zhǎng)能力和PHA的積累能力都得到增強(qiáng)。

圖2 phaZ敲除突變株的生長(zhǎng)和PHA的積累

圖3 菌株QSRZ6B的特征

3 討論

利用代謝工程法改造木質(zhì)素降解細(xì)菌是提高木質(zhì)素生物轉(zhuǎn)化率的一種有效方法，該方法可以通過(guò)表達(dá)有效的功能基因和敲除某些基因來(lái)定向合成和積累高值化合物。Vardon等［19］在敲除多余代謝分支的同時(shí)，又引入了aroY、catA和苯酚代謝通路操縱子，使P. putidaKT2440利用木質(zhì)素類似物積累己二酸，產(chǎn)量達(dá)到了13.5 g/L；Lu等［15］在蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法的指導(dǎo)下，導(dǎo)入來(lái)源于放線菌的過(guò)氧化物酶的編碼基因dyp2、香草醛脫氫酶基因vanAB以及自身的PHA合成酶基因phaJ4和phaC1，使菌株P(guān). putidaA514利用預(yù)處理后的木質(zhì)素纖維素合成PHA的量提高至161 mg/L；以香草酸為碳源時(shí)PHA含率達(dá)到了73%。

本研究以P. putidaKT2440的hsdR缺失突變株為出發(fā)菌株，利用同源重組敲除了PHA代謝基因簇中phaZ基因，構(gòu)建了phaZ缺失菌株P(guān). putidaQSRZ6。在P. putidaKT2440 基因組中，PHA 合成相關(guān)基因以基因簇（phaC1ZC2- DFI）的形式存在，phaZ基因位于phaC1與 phaC2 基因之間［20］，其編碼蛋白PhaZ為胞內(nèi)mcl-PHA 解聚酶［21］，在碳源缺乏的條件下，代謝mcl-PHAs［22］。因此，敲除phaZ基因可能有利于PHA 的積累。而phaZ基因的上下游基因phaC1和phaC2是PHA 合成基因，在利用這兩個(gè)基因片段為敲除phaZ基因的同源臂的同時(shí)，需要避免引入堿基突變。為此，我們?cè)跀U(kuò)增phaC1和phaC2基因時(shí)采用了高保真DNA 聚合酶，并通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證了QSRZ6中phaC1和phaC2的完整性。在分別以葡萄糖和木質(zhì)素為碳源培養(yǎng)QSRZ6時(shí)，該菌株的生物量明顯不同。這主要由于葡萄糖為簡(jiǎn)單糖類，易被微生物代謝利用，而木質(zhì)素本身成分復(fù)雜，含有較多芳香族類化合物，需要誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝酶類，從而降低了木質(zhì)素的利用。但不論利用葡萄糖還是木質(zhì)素，QSRZ6均獲得了最大的生物量，菌體干重較初始菌株分別提升了29%和48%。在以木質(zhì)素為碳源時(shí)，QSRZ6中PHA的積累量為124 mg/L，提高了1.8倍。Linger［13］等利用APL（木質(zhì)素含量約32%的玉米芯堿-蒽醌處理液，同時(shí)富含單糖和木質(zhì)素單體）發(fā)酵合成PHA的量為252 mg/L。相比之下，我們獲得的菌株QSRZ6B的PHA積累量要低44%。原因在于本文使用的木質(zhì)素為高純度堿木質(zhì)素（木質(zhì)素含量90%以上），僅含有少于5%的不同類型碳水化合物，比APL更為難利用，導(dǎo)致PHA的積累量也相應(yīng)較低。

進(jìn)而我們又在QSRZ6菌株中引入來(lái)源于R. jostiiRHA1的過(guò)氧化物酶（DypB）編碼基因，構(gòu)建了菌株QSRZ6B以強(qiáng)化木質(zhì)素降解能力。在以木質(zhì)素為碳源的培養(yǎng)基中，該菌的生長(zhǎng)量和過(guò)氧化物酶活性均得到了不同程度的提高，而且QSRZ6B的PHA的積累量達(dá)到140 mg/L，比QSRZ6和QRS1分別提高了13%和218%。Ahmad等［18］開(kāi)展了相似的研究工作，構(gòu)建了R. jostiiRHA1的dypB的敲除突變株，dypB缺失菌株在降解木質(zhì)素方面均具有不同程度的下降，而且在大腸桿菌中重組表達(dá)的DypB也顯示出了對(duì)Kraft木質(zhì)素和麥草原木質(zhì)素的降解活性，表明DypB在木質(zhì)素的降解過(guò)程中具有一定的作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

在hsdR基因缺失突變株的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)又敲除了phaZ基因，獲得了hsdR-phaZ雙基因缺失突變菌株P(guān). putidaQSRZ6，該突變株可以作為全局調(diào)控木質(zhì)素降解酶系統(tǒng)和PHA合成系統(tǒng)以提高利用木質(zhì)素積累PHA的優(yōu)勢(shì)出發(fā)菌株。進(jìn)而我們利用該菌株強(qiáng)化表達(dá)的異源過(guò)氧化物酶，所獲得的代謝工程菌株QSRZ6B的生長(zhǎng)情況和PHA的合成能力都得到了提高，說(shuō)明采用代謝工程的方法對(duì)木質(zhì)素降解系統(tǒng)和PHA積累途徑進(jìn)行基因修改是一種提高木質(zhì)素轉(zhuǎn)化和PHA積累量的有效方法。在未來(lái)的研究中，我們將對(duì)利用木質(zhì)素積累PHA的整體途徑進(jìn)行深入研究和理性設(shè)計(jì)，進(jìn)而將木質(zhì)素降解、芳香族化合物利用和高值產(chǎn)物的形成與積累結(jié)合起來(lái)，建立高效的利用木質(zhì)素積累PHA的細(xì)胞工廠，以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)素的高效生物轉(zhuǎn)化和PHA的低成本合成。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以P. putidaKT2440的hsdR缺失突變株P(guān).putidaQSR1為出發(fā)菌株，構(gòu)建了phaZ基因缺失突變株P(guān). putidaQSRZ6，進(jìn)而在QSRZ6中強(qiáng)化表達(dá)了R. jostiiRHA1的過(guò)氧化物酶DypB，獲得了代謝工程菌株QSRZ6B。菌株QSRZ6的生物量和PHA積累量分別增長(zhǎng)了48%和182%。QSRZ6B的PHA積累量達(dá)到了140 mg/L，相比QSRZ6和QSR1分別提高了13%和218%。