武國松 李杉

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510006）

艱難梭菌（Clostridium difficile）為革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，是抗生素藥物相關(guān)性腹瀉的主要致病菌［1-2］；由于近年來抗生素的廣泛使用，特別是強毒菌株（027/NAPI/BI）的出現(xiàn)，使得艱難梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI）在國內(nèi)外呈上升趨勢［3］；CDI常見病癥為假膜性結(jié)腸炎，外周白細胞明顯增多，腹瀉，發(fā)熱等，嚴重的會出現(xiàn)急性腎衰竭和低血壓甚至死亡，復(fù)發(fā)率高達40%［4］。

目前用萬古霉素、非達霉素作為感染的一線治療方案，然而抗生素藥物易進一步破壞腸道微生態(tài)，加重菌群失衡，從而引起反復(fù)感染［5］。1989年在駱駝的血清中發(fā)現(xiàn)一種天然缺失輕鏈只含有重鏈的抗體［9］。具有相對分子質(zhì)量小（分子量只有15 kD左右）、穩(wěn)定性強、抗原結(jié)合性能好、易表達及免疫原性低等特點。這種只由重鏈可變區(qū)構(gòu)成的單域抗體被稱為VHH抗體（Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH）［6］，亦被稱為納米抗體（Nanobody，Nb）。納米抗體具有多種優(yōu)勢［12-13］，在食品及藥物開發(fā)等領(lǐng)域擁有廣闊的前景。

本實驗室已獲得了從駝羊血清中分離的抗艱難梭菌毒素的基因E3和AA6，通過短小的連接序列（Linker）將E3及AA6串聯(lián)在一起，從而轉(zhuǎn)化成二價雙特異的形式，相比單價納米抗體，二價納米抗體具有更高的抗原識別能力及抗原親和力［7］。從而增強其對毒素B的抑制效率，為治療艱難梭菌感染奠定基礎(chǔ)。

乳酸菌是治療性蛋白載體，自身具有免疫佐劑作用，能夠在強胃酸環(huán)境下生存，不需要對抗原進行復(fù)雜的處理。乳酸菌高效表達系統(tǒng)NICE（The nisin controlled expression，NICE）是在乳鏈菌肽（Nisin）誘導(dǎo)下由 nisA 啟動子控制目的基因表達的［8］。nisin可以在含有 nisRK的菌中高度誘導(dǎo)克隆在 nisA啟動子之后的基因而自身不會產(chǎn)生內(nèi)毒素。當在菌的對數(shù)生長期時加入微量的 nisin，目的基因的濃度依賴誘導(dǎo)將會發(fā)生，且誘導(dǎo)作用與 nisin的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，誘導(dǎo)效率可高1 000倍以上［9］。

本研究應(yīng)用NICE系統(tǒng)構(gòu)建質(zhì)粒pNZ8148-E3-AA6，獲得重組乳酸乳球菌NZ9000/ pNZ8148-E3-AA6，誘導(dǎo)表達納米抗體，通過SDS-PAGE 和Western blot鑒定表達產(chǎn)物，親和層析法純化目標蛋白，并對所獲得重組二價納米抗體進行初步活性鑒定，可以中和艱難梭菌毒素TcdB的細胞毒性。本研究成功在乳酸乳球菌中表達具有抑制TcdB細胞毒性的納米抗體，旨在為治療艱難梭菌感染提供一個潛在方法，具有一定的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 乳酸乳球菌NZ9000，質(zhì)粒pNZ8148（氯霉素抗性）由江南大學(xué)生物工程學(xué)院張娟博士惠贈。M17培養(yǎng)基：購自青島海博生物技術(shù)有限公司；GM17液體培養(yǎng)基（M17培養(yǎng)基中含 0.5%葡萄糖）；G-SGM17液體培養(yǎng)基：M17干粉培養(yǎng)基37.25 g/L，蔗糖0.5 mol/L，甘氨酸2.5%，115℃高壓滅菌20 min，待冷卻至50℃以下時加入0.22 μm濾膜過濾的葡萄糖溶液，其終濃度為0.5%。細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）細胞培養(yǎng)基（Gibco），胰蛋白酶（0.25%Trypsin，Gibco），PBS緩沖液（雙螺旋生物科技，上海），胎牛血清（FBS，Gibco），青霉素和鏈霉素雙抗（Gibco），二甲基亞砜（DMSO，Sigma）

1.1.2 主要試劑及儀器 PrimerSTAR Max聚合酶、DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司。限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和SacⅠ、T4DNA 連接酶購自Thermo公司。CCK8檢測液購自背景索寶來生物科技有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒以及膠回收試劑盒購自TIANGEN公司。革蘭陽性菌質(zhì)粒小提試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，BCA Protein Assay Kit購自Thermo公司，nisin購自 Sigma公司。非洲綠猴腎細胞株（Vero細胞，實驗室保存）。其他試劑均為分析純。PCR儀Bio-Rad公司，凝膠成像儀Bio-Rad，熒光倒置顯微鏡（Olypus IX71，日本）。Spectramax M5酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)E3和AA6的基因序列，在E3基因序列的 3′端添加Linker（G4S）密碼子，在AA6的3′端添加6個His標簽，利用Primer 5.0 設(shè)計擴增基因的引物：E3-F1：5′- CATG CCATGGCTATGGCGGCCGCTTCCCAG-3′（下劃線處為NcoⅠ酶切位點），E3-R1：5′-ATCGAGCTCTTAG TGGTGGTGGTGGTGGTGTGATCCGCCTCCGCCTTGT GGTTTTGGTGTCTTGGGTTCC-3′（下劃線處為SacⅠ酶切位點）。AA6-F2 ：5′-ATCGAGCTCATGGCGGCC GCTCAGTTGCA -3′（下劃線處為SacⅠ酶切位點），AA6-R2 ：5′-CCCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTG GTGTTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTTCTGA-3′（下劃線處HindIII酶切位點），引物由生工生物工程（上海）服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 重組表達載體的構(gòu)建及蛋白小量表達 PCR分別擴增E3、AA6納米抗體編碼基因，酶切依次將AA6、E3連接至載體pNZ8148 上，雙酶切及測序鑒定獲得質(zhì)粒pNZ8148-E3-AA6。按Holo等［10］方法制備乳酸乳球菌 NZ9000感受態(tài)細胞。將連接產(chǎn)物通過電穿孔轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到NZ9000感受態(tài)細胞中，設(shè)置電壓2 000 V，電脈沖時間為1.5-5.0 ms。電轉(zhuǎn)細胞在GM17 恢復(fù)培養(yǎng)基（含20 mmol/LMgCl2，2 mmol/L CaCl2）30℃培養(yǎng)2 h后，取100 μL涂布到GM17氯霉素抗性平板上，30℃厭氧培養(yǎng)24-48 h。雙酶切進行鑒定，重組菌株為NZ9000/ pNZ8148-E3-AA6。

30℃靜置培養(yǎng)過夜的重組菌按照1∶100的比例轉(zhuǎn)接至5 mL GM17培養(yǎng)基中（氯霉素終濃度為10 ug/mL），測定不同時間點重組乳酸乳球菌 NZ9000/pNZ8148-E3-AA6的OD600值，在培養(yǎng)至菌液 OD600值為0.4-0.5時加入終濃度為 1 ng/mL 的誘導(dǎo)劑 nisin進行誘導(dǎo)表達，12 h時收集菌體。收集的菌體經(jīng)超聲破碎后，SDS-PAGE和 Western-blot鑒定。

1.2.3 重組乳酸乳球菌的大量表達 將誘導(dǎo)后的菌液500 mL離心，每克濕菌體用3 mL 5 mmol/L咪唑緩沖液重懸，菌體用高壓破碎儀進行破碎，4℃12 000 r/min離心30 min 收集上清液。將上清液加入預(yù)先用5 mmol/L咪唑緩沖液平衡的Ni-NTA 層析柱內(nèi)，分別用100（20% buffer B）mmol/L、150（30%buffer B）mmol/L咪唑緩沖液洗脫，并收集洗脫液，SDS-PAGE 電泳檢測目的蛋白分離純化效果，透析至1×PBS溶液，使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.4 CCK8法檢測二價納米抗體E3-AA6蛋白對毒素TcdB的抑制實驗 在細胞變圓實驗中，用不同濃度梯度TcdB處理Vero細胞，并且在顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。分別統(tǒng)計細胞變圓率，通過觀察統(tǒng)計得出，當毒素TcdB濃度為0.0125 ng/mL時，24 h變圓率約為70% 左右，選定此濃度為對照實驗施加毒素濃度。將對數(shù)生長期Vero細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基配制1×105/mL細胞懸液，按每孔個細胞約1×104個（100 μL）加入到96 孔細胞培養(yǎng)板中，過夜培養(yǎng)后，進行毒素中和實驗。分別設(shè)置3個實驗組：空白組、對照組、實驗組?？瞻捉M施加完全培養(yǎng)基，對照組施加完全培養(yǎng)基和0.0125ng/mL TcdB，實驗組為Vero細胞同時施加加0.0125 ng/mL TcdB和12.5、25、50 μg/mL的重組納米抗體蛋白，每個濃度設(shè)置3次平行實驗。培養(yǎng)2 h，6 h，12 h，18 h和24 h后每孔加入10 μL CCK8 檢測液，37℃孵育2 h后，酶標儀在450 nm檢測其吸光度值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 Origin 9.1.軟件及SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x-±s表示。

2 結(jié)果

2.1 重組乳酸乳球菌蛋白表達與鑒定

根據(jù)重組乳酸乳球菌的生長曲線確定菌液 OD600為 0.4-0.5時，加入nisin，終濃度為1 ng/ mL。將12h誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組乳酸乳球菌，超聲破碎處理后進行SDS-PAGE（圖1-A）可見經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌在32 kD處有與預(yù)期大小一致的條帶，未誘導(dǎo)的重組乳酸乳球菌未見相應(yīng)條帶，說明經(jīng)誘導(dǎo)的目的蛋白在重組乳酸乳球菌中獲得表達。

Western-blot、Anti-His-tag抗體檢測結(jié)果（圖2）顯示，誘導(dǎo)的重組乳酸乳球菌在32 kD處有特異性條帶，表明目的蛋白在重組乳酸乳球菌中獲得表達，通過鎳柱親和層析純化目的蛋白，SDS-PAGE檢測（圖1-B），BCAProtein Quantification Kit測定其蛋白濃度為 720 μg /mL。

圖1 表達產(chǎn)物的 SDS-PAGE分析

2.2 二價納米抗體E3-AA6蛋白對毒素TcdB的抑制

CCK8法實驗結(jié)果（圖3）表明二價納米抗體E3-AA6對TcdB有抑制作用，并且TcdB的抑制作用與納米抗體的濃度呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，根據(jù)公式：抑制率（%）={1-［OD（實驗組）-OD（空白）］/［OD（對照組）-OD（空白）］}×100，計算得出當二價納米抗體E3-AA6濃度為50 μg /mL時，對TcdB的抑制率在24 h時為39%。

圖2 表達產(chǎn)物的Western-blotting分析

圖3 納米抗體E3-AA6對毒素TcdB的抑制效應(yīng)

3 討論

艱難梭菌廣泛存在于自然環(huán)境及動物糞便中，是人體腸道中的正常菌群。由于廣泛應(yīng)用廣譜抗生素、免疫抑制劑或化療藥物等藥物，人體腸道微生物菌群平衡被擾亂，艱難梭菌大量繁殖，引發(fā)艱難梭菌感染，導(dǎo)致嚴重腹瀉和腸道炎癥甚至死亡。

目前針對艱難梭菌感染，常見的CDI治療是抗生素治療［11］，甲硝唑用于CDI輕中度患者，萬古霉素用于CDI重度患者，菲達霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，對艱難梭菌有殺菌活性，但是對其他革蘭氏陽性菌作用有限，一般用于治療復(fù)發(fā)患者［12］。但近年高毒素菌株出現(xiàn)，藥物的敏感性降低，甲硝唑和萬古霉素可進一步破壞腸道微生態(tài)平衡，艱難梭菌感染復(fù)發(fā)率很高，且治愈后復(fù)發(fā)率高達25%-60%［13］。因此抗生素藥物需要向窄譜，不可吸收，可重復(fù)給藥，安全性高等方向發(fā)展［14］。另一種新型CDI治療方式是糞菌移植法，其原理是將健康供體的糞便經(jīng)過過濾后注入到患者的結(jié)腸中，達到重新恢復(fù)正常結(jié)腸菌群的目的［15-16］。

圖4 不同濃度E3-AA6對毒素TcdB 的抑制作用

納米抗體因其分子量小、高特異性等特性，在治療艱難梭菌感染方面有著天然優(yōu)勢［17］。本實驗室獲得了從駝羊血清中分離的抗艱難梭菌毒素的基因E3和AA6，蛋白分子量分別為15 kD左右，通過Linker連接，設(shè)計成雙特異性納米抗體，通過乳酸乳球菌表達系統(tǒng)，獲得了32 kD的純化蛋白。在細胞毒素實驗中，施加0.0125 ng/mL TcdB，Vero細胞24 h的變圓率為70%，施加50 μg/mL二價納米抗體E3-AA6，細胞變圓率明顯降低，通過CCK8試劑盒測定細胞活性，抑制率達到39%。證明二價納米抗體E3-AA6對艱難梭菌TcdB有一定的中和作用。結(jié)合乳酸乳球菌可通過胃進入到腸道，直接作用于艱難梭菌，為今后的體內(nèi)實驗提供實驗依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了抗艱難梭菌毒素的重組表達載體pNZ8148- E3-AA6，通過NICE系統(tǒng)實現(xiàn)了二價納米抗體E3-AA6穩(wěn)定表達；在對Vero細胞變圓實驗及CCK8實驗中，E3-AA6能夠有效的中和艱難梭菌毒素TcdB。