羅志梅 張永彪 鄢純 韓圓圓 呼銳 劉繼強(qiáng)

（1. 北京康普森生物技術(shù)有限公司，北京 102206 2. 北京大數(shù)據(jù)精準(zhǔn)醫(yī)療高精尖創(chuàng)新中心 北京航空航天大學(xué)，北京 100191）

高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展促進(jìn)現(xiàn)代基因組學(xué)研究的蓬勃發(fā)展，然而全基因組測(cè)序因成本昂貴，分析過(guò)程復(fù)雜，使科研人員倍感壓力［1］，目標(biāo)序列捕獲技術(shù)的出現(xiàn)，在很大程度上緩解了上述的問(wèn)題。目標(biāo)序列捕獲技術(shù)是通過(guò)特異探針與基因組目標(biāo)區(qū)域雜交，有選擇性的富集基因組中的特定片段。近年發(fā)展起來(lái)的捕獲技術(shù)，如雜交捕獲技術(shù)，其樣本在雜交前被隨機(jī)打斷成500 bp左右的片段，寡核苷酸探針可能與一些含有部分目標(biāo)區(qū)段的非靶標(biāo)序列雜交，導(dǎo)致捕獲的特異性較差。多重PCR捕獲技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段，擴(kuò)增子越多，不均一性也越高，PCR擴(kuò)增的效率使其應(yīng)用受到一定的限制。分子倒置探針（Molecular Inversion Probe，MIP）技術(shù)是最新發(fā)展起來(lái)的一種分子捕獲技術(shù)，因其特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉且對(duì)DNA完整度要求不高等特點(diǎn)，使其一經(jīng)出現(xiàn)便備受青睞，被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域。本文主要對(duì)MIP技術(shù)的原理、實(shí)驗(yàn)流程、發(fā)展過(guò)程、技術(shù)特點(diǎn)及其應(yīng)用進(jìn)行了綜述，旨在使相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者對(duì)MIP技術(shù)進(jìn)行全面的了解，為研究者進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲研究時(shí)提供更多的參考和選擇。

1 MIP技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)流程

MIP技術(shù)是指線(xiàn)性的單鏈DNA序列探針與靶序列基因組雜交形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，用來(lái)捕獲目標(biāo)序列的分子生物學(xué)技術(shù)。

MIP技術(shù)的探針設(shè)計(jì)頗為新穎，是一段較長(zhǎng)的單鏈DNA序列，兩端含有大約20-40 nt長(zhǎng)度的特異序列，該序列能與靶標(biāo)序列互補(bǔ)形成含有一個(gè)核苷酸至幾百個(gè)核苷酸缺口的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以4種游離的核苷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）為原料，在DNA聚合酶作用下以靶標(biāo)序列為模板填補(bǔ)缺口；DNA連接酶催化探針兩端的3′，5′-磷酸二酯鍵，形成完整的環(huán)化探針；核酸外切酶降解反應(yīng)體系中未參與反應(yīng)的探針和基因組DNA序列，只保留環(huán)形探針；以滾環(huán)或者線(xiàn)性方式擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可用于芯片雜交或者高通量測(cè)序，獲取的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用于多種生物信息學(xué)分析。MIP技術(shù)的具體實(shí)驗(yàn)流程，見(jiàn)圖1。

圖1 MIP技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程圖

2 MIP技術(shù)的發(fā)展與改進(jìn)

2.1 MIP技術(shù)的誕生

MIP技術(shù)是基于鎖式探針技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)新型分子捕獲技術(shù)。鎖式探針是一條兩端含特異性檢測(cè)序列的DNA單鏈，探針的5′端和3′端與靶標(biāo)序列毗鄰互補(bǔ)，DNA連接酶可將線(xiàn)性的鎖式探針連接成環(huán)，如果探針兩端之間有一個(gè)堿基不能與模板互補(bǔ)配對(duì)，或者有一個(gè)堿基的空隙，則無(wú)法形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)（圖2左），因此鎖式探針技術(shù)只能檢測(cè)已知的DNA序列，用于相似DNA序列的分析［2］。Hardenbol等［3］于2003年首次報(bào)道根據(jù)鎖式探針原理開(kāi)發(fā)出MIP技術(shù)，用于單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分型分析：當(dāng)線(xiàn)性單鏈DNA探針與基因組靶標(biāo)雜交時(shí)，在靶標(biāo)序列的SNP位置有一個(gè)堿基的空隙，空隙填充的核苷酸與靶標(biāo)序列SNP位點(diǎn)的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)（圖2右）。這種改進(jìn)的探針較鎖式探針具有更多優(yōu)點(diǎn)，如對(duì)于同一SNP位點(diǎn)而言，MIP技術(shù)僅需設(shè)計(jì)一條探針即可，而鎖式探針則需設(shè)計(jì)多條探針。

最初，MIP技術(shù)僅用于SNP分型，此時(shí)的探針共由7個(gè)結(jié)構(gòu)元件組成：探針的5′和3′端各有一段與目的基因組序列互補(bǔ)的特異序列（Genomic homology region 1/2）、兩段通用引物識(shí)別序列（PCR primer Site 1/2）、與芯片特異性結(jié)合的標(biāo)簽序列（Array tag sequence）及兩段酶切序列（Probe/Tag-release cleavage site），總長(zhǎng)度約 120 nt［4］。探針與基因組DNA混合雜交形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在一系列酶促反應(yīng)下形成倒置的探針（圖3），線(xiàn)性擴(kuò)增的產(chǎn)物與芯片雜交，通過(guò)雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行SNP分型。Wang等［5］利用此技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中完整基因組DNA及FFPE樣本DNA的拷貝數(shù)變異（Copy number variation，CNV），發(fā)現(xiàn)MIP技術(shù)也適用于FFPE樣本的檢測(cè)。

圖2 鎖式探針與分子倒置探針的比較

圖3 與芯片雜交結(jié)合的MIP技術(shù)原理

2.2 MIP技術(shù)的改進(jìn)及發(fā)展

MIP技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了更長(zhǎng)基因組區(qū)域的捕獲。2007年，Akhras等［6］對(duì)探針進(jìn)行改進(jìn)，改進(jìn)后的探針由5個(gè)結(jié)構(gòu)元件組成，包括兩端與靶標(biāo)序列結(jié)合的片段，兩段通用引物配對(duì)序列及一段限制性酶切位點(diǎn)，探針3′端延伸到5′端，能形成大約100 nt的空隙填充長(zhǎng)度，他們將此探針?lè)Q為“連接倒置探針（Connector inversion probe，CIPer）”。

運(yùn)用MIP技術(shù)捕獲外顯子測(cè)序主要存在兩個(gè)困難，即捕獲效率低和雜合等位基因捕獲不均一。為了克服這些困難，2009年，Turner等［7］對(duì)MIP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)以適用于外顯子大規(guī)模的捕獲。他們延長(zhǎng)了探針與靶標(biāo)序列結(jié)合配對(duì)長(zhǎng)度及空隙填充的時(shí)間，增加了探針及連接酶的濃度，同時(shí)將線(xiàn)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)鳥(niǎo)槍法測(cè)序文庫(kù)［8］。該探針長(zhǎng)度為70 nt，包括兩端特異的雜交序列及骨架序列［9］。改進(jìn)后的MIP技術(shù)能同時(shí)擴(kuò)增并測(cè)序50 000個(gè)外顯子。

2013年，Hiatt等［10］將分子倒置探針技術(shù)與單分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，使MIP技術(shù)能借助高通量測(cè)序檢測(cè)低頻率變異；改進(jìn)后的方法被稱(chēng)為單分子分子倒置探針技術(shù)（Single molecule Molecular Inversion Probes，smMIP）。單分子標(biāo)記能去除偏差和PCR擴(kuò)增帶來(lái)的冗余序列，保留原始樣本中真實(shí)的信息，能檢測(cè)到MAF≤1%的低頻率變異。該探針主要由3部分構(gòu)成（圖4）：5′-3′端與靶標(biāo)序列互補(bǔ)的片段（Targeting arm）、骨架序列（Backbone）和單分子標(biāo)記序列（Molecular tag）。此時(shí)使用的PCR擴(kuò)增正向引物序列包括：測(cè)序引物序列和Illumina接頭序列1，反向引物包括：測(cè)序引物序列、條形碼序列和Illumina接頭序列2。因此運(yùn)用此技術(shù)擴(kuò)增的產(chǎn)物無(wú)需再構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)，可直接進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，簡(jiǎn)化步驟節(jié)約時(shí)間。

圖4 與測(cè)序技術(shù)結(jié)合的smMIP流程圖

為了降低MIP技術(shù)檢測(cè)的費(fèi)用，2012年，O’Roak等［11］采用新的MIP設(shè)計(jì)算法改進(jìn)工作流程、優(yōu)化捕獲步驟及條件使其適用于高通量檢測(cè)，開(kāi)發(fā)出了在大樣本中實(shí)現(xiàn)超低花費(fèi)的多重靶向候選基因重測(cè)序新探針，使得每個(gè)樣本的單個(gè)基因檢測(cè)費(fèi)用少于1美元。除此之外，所需 DNA樣品量少，靈敏度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別可達(dá)到99%和98%，顯著提高了捕獲的效率。

2014年中國(guó)研究者將MIP技術(shù)與操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用更低的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合，用于區(qū)分乙型肝炎病毒菌株單一位點(diǎn)的SNP分型，MIP探針與目的序列雜交后，探針的3′端獲得一個(gè)與靶標(biāo)序列SNP位點(diǎn)互補(bǔ)的堿基空隙，反應(yīng)產(chǎn)物分為4等份，每一等份加入一種游離的核苷酸填充空隙，隨后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)泳道條帶對(duì)應(yīng)加入的核苷酸種類(lèi)即可判斷SNP分型［12］（圖5）。

圖5 MIP技術(shù)與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合檢測(cè)SNP分型模式圖

2014年，Carrascosa等［13］將MIP技術(shù)與等離子體共振技術(shù)（Surface plasmon resonance technology，SPR）結(jié)合，用于檢測(cè)DNA甲基化區(qū)域。具體改進(jìn)的地方包括：探針與經(jīng)過(guò)亞硫酸氫鹽處理過(guò)的基因組DNA和未處理的基因組DNA雜交形成環(huán)形探針后，通過(guò)不對(duì)稱(chēng)PCR進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生單鏈寡核苷酸DNA序列，與固定在SPR上的生物傳感芯片雜交，Reading Oligo只與含有甲基化序列的片段結(jié)合而使SPR信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)，從而將含有甲基化的片段與非甲基化片段區(qū)分開(kāi)。具體流程如圖6。

圖6 MIP技術(shù)檢測(cè)甲基化流程［13］

3 MIP技術(shù)的特點(diǎn)

分子倒置探針與線(xiàn)性探針相比，能夠指數(shù)級(jí)減少由于線(xiàn)性引物所引起的交叉反應(yīng)及二聚體。此外，MIP技術(shù)還具有如下主要特點(diǎn)。

3.1 特異性強(qiáng)

通過(guò)探針與基因組序列雜交互補(bǔ)來(lái)捕獲靶標(biāo)序列，減少了非特異性序列的影響。DNA聚合酶、連接酶和核酸外切酶等一系列酶促反應(yīng)處理后，降解反應(yīng)體系中的線(xiàn)性探針及基因組DNA序列，有效減少其對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，降低背景對(duì)結(jié)果的干擾［5］。此外，DNA聚合酶校正3′端的錯(cuò)配能力較5′端高，MIP探針3′端的單堿基延伸及后續(xù)的連接反應(yīng)確保能更好的區(qū)分出單個(gè)堿基突變。這些巧妙的設(shè)計(jì)顯著增強(qiáng)了MIP技術(shù)的特異性。而其他傳統(tǒng)捕獲技術(shù)如雜交捕獲因探針可與非靶標(biāo)序列結(jié)合，而造成特異性較差。

3.2 對(duì)DNA樣品完整度要求不嚴(yán)格

探針兩端與靶標(biāo)序列結(jié)合的長(zhǎng)度僅需40 bp左右，因此適用于部分降解的DNA樣本。而高通量測(cè)序需要靶向富集和深度覆蓋，才能獲得福爾馬林石蠟包埋樣本（Formalin-fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE）的拷貝數(shù)信息。正因如此，Affymetrix公司基于MIP技術(shù)針對(duì)900個(gè)癌基因優(yōu)化設(shè)計(jì)探針，研發(fā)出適用于FFPE樣本的OncoScanTMFFPE Assay kit和OncoScanTMCNV FFPE Assay Kit，該試劑盒在一次試驗(yàn)中可同時(shí)檢測(cè)出拷貝數(shù)變異、雜合性丟失等信息。

3.3 操作簡(jiǎn)單、時(shí)間短

MIP技術(shù)檢測(cè)中用到的試劑、儀器都非常常見(jiàn)，許多實(shí)驗(yàn)室均能滿(mǎn)足其操作要求。同時(shí)，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，除使用線(xiàn)性擴(kuò)增外，還可以采用滾環(huán)擴(kuò)增，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需專(zhuān)門(mén)構(gòu)建文庫(kù)便可以直接上機(jī)測(cè)序，這不僅簡(jiǎn)化操作步驟還大大縮短操作時(shí)間。例如，羅氏NimbleGen基于此技術(shù)最新推出的針對(duì)腫瘤和遺傳病研究的HEAT-Seq目標(biāo)片段富集系列產(chǎn)品如HEAT-SEQ oncology panel，具有操作流程簡(jiǎn)單省時(shí)的特點(diǎn)，且不乏高效可信的變異檢測(cè)能力。從樣本DNA提取到完成測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建耗時(shí)不足8 h，其中手工操作時(shí)間不到2 h。

3.4 所需DNA樣品少，花費(fèi)低

基于MIP技術(shù)捕獲的目標(biāo)序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后可以直接上機(jī)測(cè)序，因此只需少量的DNA樣品即可完成操作（≥200 ng）。而PCR捕獲技術(shù)、雜交捕獲技術(shù)需要的樣品量要達(dá)到μg級(jí)。此外，盡管MIP技術(shù)總體費(fèi)用較高，但與其他捕獲技術(shù)相比，背景對(duì)目的片段的富集影響小，使得其通量更高，進(jìn)而將每個(gè)樣本的單個(gè)基因檢測(cè)花費(fèi)降低到不足1美元［10］。

3.5 重復(fù)性高

使用MIP捕獲技術(shù)結(jié)合芯片雜交對(duì)同一個(gè)體SNP進(jìn)行分型時(shí)，重復(fù)性可以達(dá)到99.9%［3］。

3.6 MIP技術(shù)不足

MIP技術(shù)在捕獲目的序列的過(guò)程中，捕獲的目的序列不能過(guò)長(zhǎng)，否則空間效應(yīng)可能會(huì)影響探針與靶標(biāo)序列的成功雜交，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此適用于小規(guī)模DNA片段的研究（≤5 Mb）。此外，對(duì)于一些位點(diǎn)如高GC含量區(qū)目前還無(wú)法設(shè)計(jì)探針，因此捕獲效率較差。

4 MIP技術(shù)在疾病研究上的應(yīng)用

人類(lèi)基因組計(jì)劃和國(guó)際人類(lèi)基因組單倍型圖計(jì)劃（HapMap）的完成以及生物芯片研發(fā)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了人們對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)與理解，為疾病的預(yù)防、診斷及治療提供了新的思路。值得注意的是，研究人員利用MIP技術(shù)參與HapMap項(xiàng)目的實(shí)施，用于7號(hào)染色體上成千上萬(wàn)個(gè)SNP的分型，其中大于11 000個(gè)非同義SNP被歸為HapMap項(xiàng)目的一部分［14］。MIP技術(shù)作為一種新型的分子捕獲技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)在研究人類(lèi)疾病方面具有其獨(dú)特的價(jià)值。

4.1 在遺傳疾病方面的應(yīng)用

孤獨(dú)癥譜系障礙（Autism spectrum disorder，ASD）近年呈現(xiàn)逐漸攀升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響人類(lèi)正常生活。2012年，O′Roak等［11］利用MIP技術(shù)對(duì)2000多位受到不同類(lèi)型ASD影響的患者進(jìn)行了多基因分析發(fā)現(xiàn)，6種頻發(fā)突變可能是造成1%偶發(fā)性ASD的病因。2016年，中南大學(xué)夏昆教授課題組利用MIP技術(shù)在1 543例中國(guó)人群ASD患者中完成了針對(duì)189個(gè)前期研究所提示的孤獨(dú)癥風(fēng)險(xiǎn)基因的靶向捕獲測(cè)序，并在29個(gè)孤獨(dú)癥相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)基因中發(fā)現(xiàn)大約4%的患者都攜帶與孤獨(dú)癥相關(guān)的de novo（DN）突變，從而揭示了我國(guó)孤獨(dú)癥患者潛在的病因［15］，這項(xiàng)研究不僅填補(bǔ)了我國(guó)孤獨(dú)癥研究領(lǐng)域的空白，同時(shí)在國(guó)際上也屬于領(lǐng)先水平。

脊髓性肌萎縮（Spinal muscular atophy，SMA）是常染色體隱性遺傳病，也是最常見(jiàn)的致死性神經(jīng)肌肉疾病之一。臺(tái)灣研究者設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的MIP探針用于識(shí)別相同的核苷酸變異，采用不連續(xù)滾環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，利用短柱毛細(xì)管電泳檢測(cè)不同長(zhǎng)度PCR產(chǎn)物的基因型，通過(guò)檢測(cè)SMN1基因和SMN2基因的劑量來(lái)進(jìn)行SMA的診斷［16］。

4.2 在癌癥方面的研究

在癌癥研究領(lǐng)域，MIP技術(shù)最先應(yīng)用于結(jié)腸直腸癌的研究。Ji等［17］分別對(duì)200多個(gè)癌基因及染色體臂18q設(shè)計(jì)MIP探針，分析結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和原發(fā)性結(jié)腸直腸癌基因拷貝數(shù)變異及外顯子突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原發(fā)性腫瘤有幾類(lèi)不同的結(jié)腸直腸癌，并且每類(lèi)都有特定基因及18q缺失，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義，18q丟失可以作為II期結(jié)直腸癌輔助治療的潛在指標(biāo)。Zhang等［18］利用MIP技術(shù)檢測(cè)140例≤35歲患家族或非家族結(jié)腸直腸癌患者的7個(gè)易感基因，結(jié)果表明16例患者中6個(gè)基因發(fā)生變異，5例患者APC基因發(fā)生致病突變，3例患者M(jìn)LH1基因發(fā)生致病突變，以及2例患者M(jìn)SH2基因發(fā)生致病突變，此外3例患者檢測(cè)到新的突變。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明利用MIP技術(shù)診斷孟德?tīng)柺浇Y(jié)腸直腸癌綜合癥是可靠的。

基質(zhì)金屬蛋白酶-7（MMP-7）是一類(lèi)具有廣泛底物的分泌蛋白水解酶，能夠降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，許多研究已經(jīng)表明其表達(dá)與各種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及存活有關(guān)［19-21］。Beeghly-Todiel等［22］利用MIP技術(shù)結(jié)合芯片雜交對(duì)MMP-7基因中11個(gè)SNP進(jìn)行基因分型，評(píng)估MMP-7中SNP與乳腺癌存活之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-7基因多態(tài)性是中國(guó)女性乳腺癌患者生存的重要決定因素。拷貝數(shù)變異一直是了解乳腺癌潛在分子機(jī)制的有效工具，Thompson等［23］使用高密度的MIP探針檢測(cè)971例乳腺癌Ⅰ期/Ⅱ期患者染色體拷貝數(shù)增加或缺失情況，鑒定出了12個(gè)新的拷貝數(shù)變異作為預(yù)后標(biāo)記。隨后，研究者繼續(xù)利用MIP技術(shù)對(duì)乳腺癌患者的不同染色體的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后策略提供了非常重要的參考價(jià)值［24-27］。乳腺癌易感基因主要有BRCA1和BRCA2這兩種，這兩種基因發(fā)生突變患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)75%和65%。因此，對(duì)BRCA1/2基因的檢測(cè)顯得尤為重要。Neveling等［28］利用smMIP技術(shù)分析BRCA1和BRCA2基因編碼區(qū)拷貝數(shù)變異，并開(kāi)發(fā)出一種基于smMIP技術(shù)的自動(dòng)化操作流程。

卵巢癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，MIP技術(shù)有助于提高對(duì)卵巢癌腫瘤發(fā)生過(guò)程和疾病進(jìn)展階段的了解。2008年，Brown等［29］采用MIP技術(shù)對(duì)33例卵巢高級(jí)別漿液性癌患者中11q13區(qū)的擴(kuò)增子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增子的核心區(qū)域位于4個(gè)致癌基因的6 Mb區(qū)域內(nèi)，在卵巢癌早期4個(gè)癌基因擴(kuò)增與漿液性腫瘤密切相關(guān)。研究者利用同樣的技術(shù)對(duì)抑制受體酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)的Sprouty蛋白基因座進(jìn)行拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢高級(jí)別漿液性癌患中Sprouty 2的拷貝數(shù)缺失失，過(guò)表達(dá)Sprouty將增加表皮生長(zhǎng)因子（EGF）誘導(dǎo)的E-鈣黏連蛋白的表達(dá)，抑制EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲［30］。Weren等［31］利用smMIP技術(shù)對(duì)BRCA1和BRCA2基因進(jìn)行捕獲測(cè)序，獲得的結(jié)果為卵巢癌的治療策略提供重要的參考價(jià)值。

腎細(xì)胞癌簡(jiǎn)稱(chēng)腎癌，男性發(fā)病率高于女性。為了確定與透明細(xì)胞乳頭狀腎細(xì)胞癌有潛在關(guān)系的遺傳變異并評(píng)估MIP技術(shù)在檢測(cè)腎癌FFPE樣本的可行性，Alexiev等［32］利用MIP技術(shù)對(duì)兩種透明細(xì)胞乳頭狀腎細(xì)胞癌進(jìn)行SNP分型分析，結(jié)果表明基于MIP技術(shù)的SNP芯片可以很好的檢測(cè)雜合性缺失及中性拷貝雜合性缺失，并且MIP技術(shù)對(duì)FFPE樣本的檢測(cè)效果良好，商業(yè)化OncoScan FFPE Assay kit（Affymetrix，Santa Clara，CA）能夠快速、經(jīng)濟(jì)地利用腫瘤樣本中的少量DNA檢測(cè)出全基因組拷貝數(shù)變異、雜合性丟失及體細(xì)胞突變。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌也被認(rèn)為是一種代謝性癌癥，大約80%患癌都是由VHL基因失活突變或者表觀遺傳沉默導(dǎo)致的代謝異常引起的［33-34］。Bitter等［35］采用新型 smMIP技術(shù)檢測(cè)編碼代謝酶的基因活性及其突變情況，研究結(jié)果顯示smMIP技術(shù)可以提供有關(guān)代謝途徑的相關(guān)信息，檢測(cè)出調(diào)節(jié)代謝的靶基因活性，并且費(fèi)用較低操作流程簡(jiǎn)單。

研究表明許多腫瘤發(fā)生的早期階段抑癌基因甲基化增加，因此可通過(guò)DNA甲基化譜進(jìn)行癌癥的診斷及預(yù)后分析。肝癌是臨床上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，早期階段治療比晚期階段治療具有更好的預(yù)后效果。2017年，Xu等［36］利用MIP技術(shù)捕獲亞硫酸氫鹽處理過(guò)的肝癌組織DNA及正常血液ctDNA，通過(guò)深度測(cè)序檢測(cè)DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)肝癌組織的DNA甲基化與血漿中的ctDNA甲基化具有強(qiáng)相關(guān)性，之后通過(guò)多種統(tǒng)計(jì)方法開(kāi)發(fā)出了可用甲基化標(biāo)記進(jìn)行診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的模型。

此外，MIP技術(shù)還用于其他腫瘤的研究，如黑素瘤、Burkitt淋巴瘤、尤因肉瘤、白血病、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞肉瘤［37］、膽管癌［38］和胃癌［39］等，為這些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后研究作出了重要的貢獻(xiàn)。

4.3 在其他疾病方面的研究

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康的病原微生物，其耐藥基因突變檢測(cè)對(duì)指導(dǎo)臨床抗病毒藥物治療具有重要意義。唱?jiǎng)P等［12］利用MIP技術(shù)對(duì)病毒HBV耐藥基因突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳的MIP技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致，并成功建立了檢測(cè)HBV耐藥基因單堿基突變的MIP技術(shù)，為以后檢測(cè)HBV耐藥基因單堿基突變提供重要的參考價(jià)值。近年來(lái)，糖尿病的患者越來(lái)越多，并且患病的人群中青少年呈大幅度增加，因此對(duì)于糖尿病的研究引起很多學(xué)者的關(guān)注。Smyth等［40］利用MIP技術(shù)結(jié)合芯片雜交分析1型糖尿?。═1D）易感區(qū)域，結(jié)果在染色體2q24.3上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的T1D易感區(qū)域，此區(qū)域的一個(gè)基因KCNH7可能參與胰島素的分泌過(guò)程。此外，研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的許多疾病是由RNA錯(cuò)剪接造成的，MIP技術(shù)同樣可用來(lái)檢測(cè)可變剪接位點(diǎn)，Bachmann-Gagescu等［41］通過(guò)該技術(shù)捕獲了Joubert綜合征相關(guān)的28個(gè)基因及編碼纖毛發(fā)生所需的中心體蛋白KIAA0586基因的全外顯子，并通過(guò)Illumina HiSeq測(cè)序，發(fā)現(xiàn)KIAA0586基因第23號(hào)外顯子最后一對(duì)堿基發(fā)生同義突變，此突變使得該處出現(xiàn)隱蔽剪接位點(diǎn)，導(dǎo)致移碼突變使蛋白翻譯提前終止。

5 結(jié)語(yǔ)

目標(biāo)序列捕獲是目前基因組學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)，與全基因組測(cè)序相比，不僅降低了高通量測(cè)序的費(fèi)用而且結(jié)果分析更加容易。MIP技術(shù)作為一種新的目標(biāo)序列捕獲技術(shù)，自2003年首次報(bào)道至今，已被各領(lǐng)域的學(xué)者或?qū)＜也粩嗟母倪M(jìn)和優(yōu)化，捕獲的片段長(zhǎng)度從一個(gè)核苷酸增加到幾百個(gè)核苷酸，檢測(cè)范圍也從SNP分型擴(kuò)大到拷貝數(shù)變異、雜合性丟失、DNA甲基化及可變剪接等。MIP技術(shù)不僅在疾病研究方面應(yīng)用廣泛，在其他方面例如植物病原菌檢測(cè)等領(lǐng)域也發(fā)揮重要的作用。盡管MIP技術(shù)的探針制備費(fèi)用較昂貴，但核酸外切酶消化未反應(yīng)的線(xiàn)性探針，減少了背景對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，其通量往往很高，同時(shí)能捕獲成千上萬(wàn)個(gè)基因，對(duì)于大樣本檢測(cè)而言，費(fèi)用較低。與其他目標(biāo)序列捕獲技術(shù)相比，MIP技術(shù)不僅所需要的DNA含量少、對(duì)樣本的完整度要求不高，而且實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、時(shí)間也短。

縱然MIP技術(shù)經(jīng)歷了不斷的發(fā)展和改進(jìn)，但其仍然存在一些不足。研究發(fā)現(xiàn)，探針的捕獲效率不超過(guò)90%，捕獲的目的片段較短，甚至一些位點(diǎn)無(wú)法設(shè)計(jì)出探針及MIP技術(shù)結(jié)果分析存在欠缺。因此，具有較高捕獲效率的探針和相應(yīng)的分析軟件還需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)。另外，由于每個(gè)探針的工作效率不同，MIP文庫(kù)的構(gòu)建仍需優(yōu)化。考慮到該技術(shù)在分子生物學(xué)的廣泛應(yīng)用，若在今后的研究中能夠很好地克服以上的不足，該方法將為疾病診斷、分子病理學(xué)研究及疾病治療等方面提供強(qiáng)有力的手段。