華濤 李勝男 邸志琿 周博 曾文爐 周啟星 李鳳祥

（南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室 天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室，天津 300350）

隨著工業(yè)社會的快速發(fā)展，人類對石油能源的需求量在不斷增加。目前，陸地石油開采日漸衰竭，海底油田受到越來越多的關(guān)注。受工藝水平的限制，石油在開采、煉制、儲存、運輸及加工應(yīng)用過程中的泄漏難以避免（表1），導(dǎo)致每年會有大量的石油污染物進(jìn)入水體環(huán)境［1］，主要體現(xiàn)在以海洋為代表的咸水體系及以地下水為代表的湖泊淡水體系。石油污染事故頻頻發(fā)生，使得海洋尤其是沿海地區(qū)的水體環(huán)境惡化得十分嚴(yán)重，石油類污染物已經(jīng)成為主要污染物之一［2］。

表1 石油污染來源及污染事故分布

石油成分復(fù)雜，主要由鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴這些烴類化合物組成［3］。研究表明，石油污染區(qū)的毒性主要來自于苯、甲苯、二甲苯等芳烴類和酚類化合物，這些物質(zhì)對人和動物的毒性較大，其中，長鏈烷烴由于不易揮發(fā)、難以降解等特點對環(huán)境的危害也更持久［4］。水體石油污染將影響水域生物群落的正常生長繁殖、破壞種群間的信息傳遞，污染嚴(yán)重的區(qū)域會造成物種窒息死亡、水產(chǎn)品質(zhì)量下降，對人體及生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的影響［5］。

基于水體石油污染的嚴(yán)重性，研究人員開發(fā)了一系列處理技術(shù)，具體包括物理處理法、化學(xué)處理法及生物處理法［4，6-7］。其中生物法與其他方法相比，具有投資少、能耗低、運行費用小、無二次污染、操作簡單及除油率較高的優(yōu)點。處理原理主要是利用微生物的代謝能力，將環(huán)境中的石油烴類污染物分解成對環(huán)境無害的H2O、CO2及其他無毒物質(zhì)。除此之外，自然界是一個巨大的微生物資源庫，降解石油的微生物菌群廣泛存在于其中，易于獲得。

為了研發(fā)和擴(kuò)展微生物修復(fù)水體石油污染的實際應(yīng)用，達(dá)到修復(fù)效果好價格低廉的目的，本文綜述了石油烴生物降解機(jī)制和反應(yīng)機(jī)理，以期為水體石油污染修復(fù)提供借鑒作用。

1 降解石油烴的微生物

微生物廣泛存在于水體、土壤及大氣等環(huán)境中。石油污染區(qū)域的微生物可在自然條件下馴化產(chǎn)生大量的石油烴降解菌。研究表明，一般情況下，只有1%的微生物可以降解石油烴，但是在石油污染的區(qū)域中，可降解石油烴的微生物比例可提高到10%［1］。許多微生物是以石油烴為碳源和能源進(jìn)行生長繁殖［8］，因此科研人員定向篩選可降解石油烴微生物，并在實驗室和受污水域?qū)κ蜔N進(jìn)行降解。Poulomi等［9］研究證實，有效降解石油烴的細(xì)菌天然存在于煉油廠復(fù)雜的廢物中，并從中篩選出Burkholderia、Kocuria、Enterobacter和Pandoraea四種菌用于石油烴的降解。目前，已發(fā)現(xiàn)能降解石油烴的微生物有200多種［10］。微生物主要種類如表2-4。

2 微生物對石油的降解機(jī)制

石油主要是由鏈烷烴、環(huán)烷烴和芳香烴這些烴類化合物組成。在適宜條件下，微生物以石油烴作為碳源為其生長繁殖提供所需的能量，經(jīng)過一系列自身代謝反應(yīng)如氧化還原、分解合成等生化作用，將石油降解成無害的CO2與H2O等［13］。其代謝機(jī)理主要是微生物利用體內(nèi)各種酶與石油烴及其中間產(chǎn)物發(fā)生脫氫作用、羥化作用和過氧化作用，這其中既包括有氧降解也包括厭氧降解。有氧降解占主體，厭氧降解由于環(huán)境條件限制只能降解較少的一類固定烴類。對微生物降解機(jī)制的研究有助于提高石油烴降解能力及降解速率。

表2 降解石油烴的細(xì)菌

表3 降解石油烴的真菌

表4 降解石油烴的藻類

2.1 石油的有氧降解

石油的有氧降解是好氧微生物和兼性微生物以分子氧作為最終電子受體，以石油烴作為底物進(jìn)行的代謝，通過呼吸鏈將氧化過程產(chǎn)生的電子交給氧的過程，最終將石油烴有機(jī)物轉(zhuǎn)化為CO2、H2O和NH3。有氧降解速率快，因此要求氧氣要充分，如果分子氧不足就會導(dǎo)致降解過程缺少受氫體，從而影響微生物的正常生長［23］。有氧降解對環(huán)境要求不高，pH值在6.5-8.5范圍內(nèi)即可。

2.1.1 鏈烷烴的降解 鏈烷烴根據(jù)其結(jié)構(gòu)可分為直鏈烷烴和支鏈烷烴。支鏈烷烴的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，很難被微生物利用，它的存在增加了微生物降解石油烴的難度，且支鏈越多，微生物降解的難度越大。鏈烷烴的降解主要有末端氧化、次末端氧化、β-氧化和ω-氧化［24-25］。其中末端氧化在直鏈烷烴代謝過程中最為常見，即通過氧化直鏈烷烴末端的甲基，轉(zhuǎn)化為醇后再依次轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醛和脂肪酸，脂肪酸通過β-氧化降解形成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步分解生成CO2和H2O，并產(chǎn)生能量。有些有機(jī)物在鏈烷烴的次末端插入氧，生成仲醇后進(jìn)一步氧化再生成酮，酮代謝為酯，酯裂解生成伯醇和脂肪酸后繼續(xù)氧化成醛和羧酸，羧酸經(jīng)過β-氧化等一系列反應(yīng)最后生成CO2和H2O。直鏈烷烴的生物降解過程與降解產(chǎn)物如下：

正烷烴 → 羧酸 → 二碳單位的短鏈脂肪酸 + 乙酰輔酶A → CO2+ H2O

鏈烷烴末端甲基遭受微生物的氧化作用時，由不同功能氧化酶催化氧化生成伯醇，再進(jìn)一步氧化成醛和脂肪酸，脂肪酸按照β-氧化進(jìn)一步氧化分解，最終生成 CO2和 H2O［26］。反應(yīng)式如圖 1。

直鏈烷烴的次末端受到微生物作用時，會在鏈內(nèi)插入氧生成仲醇，再進(jìn)一步氧化生成酮，接著酮代謝為酯，酯鍵裂解生成脂肪酸與伯醇，脂肪酸再經(jīng)過ω-羥基化反應(yīng)使雙末端甲基被氧化生成二羧酸，伯醇繼續(xù)氧化生成醛與羧酸，羧酸按照β-氧化進(jìn)一步氧化分解，最終生成CO2與H2O［25，27］。反應(yīng)式如圖2。

圖1 直鏈烷烴末端氧化降解途徑

圖2 直鏈烷烴次末端氧化降解途徑

直鏈烷烴也可以直接脫氫生成烯烴，再通過酶的催化氧化作用，而后進(jìn)一步生成醇與醛，最后生成脂肪酸，脂肪酸按照β-氧化進(jìn)一步分解，最終生成 CO2與 H2O［28］。其中，酶是以輔酶Ⅱ（NADP）為主，起到傳遞質(zhì)子及能量的作用。反應(yīng)式如圖3。

圖3 直鏈烷烴β-氧化降解途徑

在直鏈烷烴發(fā)生ω-氧化時，首先會將烴氧化生成烷基過氧化氫，而后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成脂肪酸。脂肪酸再按照β-氧化進(jìn)一步氧化分解，最終生成CO2與H2O。反應(yīng)式如圖4。此過程通常也需要酶的加入，如醇脫氫酶和醛脫氫酶。

2.1.2 環(huán)烷烴的降解 脂環(huán)化合物通常很難降解，不能作為微生物生長的唯一碳源。烷基取代的脂環(huán)化合物可能被氧化的兩個位置是側(cè)鏈和酯環(huán)。環(huán)烷烴的降解主要由兩種不同氧化酶協(xié)同作用完成，一種氧化酶將其氧化為環(huán)醇脫氫形成環(huán)酮，另一種氧化酶主要氧化環(huán)酮，使環(huán)斷開后繼續(xù)深入降解為CO2與H2O［29］。降解過程與降解產(chǎn)物如下。

圖4 直鏈烷烴ω-氧化降解途徑

反應(yīng)式如圖5。

圖5 環(huán)己烷降解途徑

2.1.3 芳香烴的降解 芳香烴相比于烷烴較難降解，其機(jī)理在過去的幾十年里人們做了大量的研究工作，尤其是常見的菲和芘及其同系物。一般降解芳香烴的微生物能產(chǎn)生氧化酶將苯環(huán)羥基化，并進(jìn)一步深入降解化合物［30］。雖然微生物降解的途徑不一樣，但是關(guān)鍵性的中間產(chǎn)物是一致的。在有氧條件下，微生物利用加氧酶轉(zhuǎn)化芳香烴，通過烴基化形成二醇，而后形成鄰苯二酚，鄰位或間位開環(huán)［31］。鄰位開環(huán)生成己二烯二酸，再氧化為β-酮己二酸，繼而降解為三羧環(huán)的中間產(chǎn)物。間位開環(huán)生成2-羥己二烯半醛酸，進(jìn)一步分解成丙酮酸、乙醛和甲酸。降解過程與降解產(chǎn)物如下：

含有烷基的芳香烴，烷基取代基氧化為羧酸；生物降解多環(huán)芳烴一般先將一個環(huán)二羥基化，再進(jìn)一步降解為丙酮酸和CO2，以同樣方式進(jìn)行其他環(huán)分解，從而降解多環(huán)芳烴。

芳香烴類代謝的可能途徑如圖6。

圖6 芳香烴降解途徑

2.2 石油烴的厭氧降解

厭氧降解是指在無分子氧的情況下，厭氧微生物及兼性厭氧微生物以非氧物質(zhì)（如硝酸鹽、二氧化碳）作為最終電子受體，以有機(jī)物作為電子供體降解有機(jī)物生成化學(xué)能。厭氧降解被認(rèn)為是降解石油烴的方法中一個比較有前途的技術(shù)［32］。

石油烴的厭氧降解一般由厭氧菌和兼性厭氧菌共同作用。降解過程中有機(jī)物被轉(zhuǎn)化為CH4、NH3等，且轉(zhuǎn)化速率慢，需要時間長。厭氧降解對環(huán)境要求嚴(yán)格，pH在6.7-7.4之間。一般厭氧環(huán)境大致分為：發(fā)酵、嚴(yán)格的產(chǎn)甲烷環(huán)境、硫酸鹽為最終電子受體、硝酸鹽為最終電子受體以及Fe3+為最終電子受體［21］。厭氧降解比有氧降解種類更多，主要可分為5類，即將在末端的第二位或第三位碳原子上進(jìn)行羥基化、將延胡索酸加成到烴的甲基或亞甲基上、苯環(huán)上未被取代碳原子的羧基化、烯烴雙鍵和炔烴三鍵的水合作用以及反甲烷生成［33］。以下簡述前兩種最為常見的降解方式。

2.2.1 脫氫羥基化 厭氧降解帶有較低C-H鍵能的烴類（如乙苯），可通過與水發(fā)生脫氫羥基化反應(yīng)來進(jìn)行厭氧降解。在厭氧降解的研究中，來自于硝酸鹽還原菌的乙苯脫氫酶是最早被研究的生物酶之一［34］，在其催化作用下乙苯的乙基鏈發(fā)生脫氫過程，并與水結(jié)合形成1-苯基乙醇，脫氫產(chǎn)生苯乙酮，再經(jīng)過羧化、活化和硫解進(jìn)而產(chǎn)生苯甲酰輔酶A［35］。如圖7所示。

圖7 硝酸鹽還原菌厭氧降解乙苯

2.2.2 延胡索酸鹽加成 研究表明，厭氧降解過程中許多烴類化合物會以一種新反應(yīng)進(jìn)行初始活化，即烴的烷基鏈與延胡索酸鹽結(jié)合，生成芐基琥珀酸酯類的中間產(chǎn)物，繼而被琥珀酰輔酶A取代進(jìn)一步β-氧化，產(chǎn)生芐基輔酶A并釋放琥珀酰輔酶，然后在反應(yīng)過程中釋放出延胡索酸鹽繼續(xù)循環(huán)［36］。Kniemeyer等［37］分離到一株硫酸鹽還原菌，它在降解乙苯的過程中采用延胡索酸鹽加成的方式，如圖8所示。

圖8 硫酸鹽還原菌厭氧降解乙苯

3 微生物降解石油的影響因素

3.1 烴類的結(jié)構(gòu)

石油烴的理化性質(zhì)及生物可利用性對微生物的降解起到關(guān)鍵性作用，石油烴結(jié)構(gòu)不同，降解的難易程度也不同［38］。對于飽和脂肪烴，支鏈烷烴較難降解，支鏈的存在增強(qiáng)了烷烴的抗降解能力，支鏈越多，被生物降解的難度越大。芳香烴類化合物由于具有穩(wěn)定的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，更難被降解。不同烴類化合物微生物可降解性次序為：雜環(huán)芳烴＜多環(huán)芳烴＜單環(huán)芳烴＜C10-C24或更長的支鏈烷烴＜小于C10的支鏈烷烴＜C10-C24或更長的直鏈烷烴＜小于C10的直鏈烷烴［39］。

3.2 微生物種類

微生物降解石油大部分是通過酶促反應(yīng)實現(xiàn)的，微生物種類不同其代謝途徑及物質(zhì)傳遞方式也不相同。自然環(huán)境中的微生物多種多樣，石油的降解是一個極為復(fù)雜的過程，需要多種微生物的共同參與協(xié)同完成。研究比較了混合菌群與5種單一純菌株對液相石化油性污泥中的脂肪烴和芳香烴的降解能力，結(jié)果證明混合菌的生化降解能力更強(qiáng)，脂肪烴和芳香烴的去除率分別達(dá)到90.7%和51.8%［40］。

3.3 環(huán)境因子

環(huán)境因子對石油的降解影響顯著，如pH［41］、溫度［42］、鹽度［43］、含氧量［44］和營養(yǎng)物質(zhì)［45］。pH和含氧量能夠直接影響到微生物的生長，從而間接的影響到石油烴的降解；溫度的改變可以使石油污染物的黏度和溶解性發(fā)生變化，也能影響到微生物的生長狀況和其體內(nèi)的酶活性，從而影響石油的整個降解過程。Thamer等［43］報道稱高的鹽度和溫度會阻礙微生物及其代謝產(chǎn)物的生長產(chǎn)生。自然條件下微生物的生長繁殖離不開氮磷鉀等營養(yǎng)物，降解過程中石油烴雖然能為微生物提供碳源，但并不能為微生物充分地提供其他必需的營養(yǎng)元素，可以在降解過程中適當(dāng)?shù)丶尤肽蛩亍⒘姿猁}和鉀肥等來促進(jìn)微生物的生長［45］。

4 微生物降解石油的應(yīng)用

由于微生物廣泛存在于石油污染的環(huán)境中，經(jīng)過一定時間的人工馴化，可以有效提煉出高效定向的降解菌。近年來已有科研工作者對微生物降解石油污染組分應(yīng)用做了深入研究。BTEX（苯、甲苯、乙苯和二甲苯）是重要的石油芳烴化合物，廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，是環(huán)保部門評定的優(yōu)先污染物?；诖耍珺ei等［46］通過實驗證實用r-Fe2O3磁性固定微生物細(xì)胞，可以有效的降低傳統(tǒng)固定化過程中的傳質(zhì)阻力，提高生物降解含BTEX等芳烴類化合物石油廢水的能力。

生物治理是利用天然微生物解決原油泄露事件的有效技術(shù)，但是在海洋沉積物中氧氣的含量較少，微生物降解石油類物質(zhì)困難，最終導(dǎo)致烴類污染加劇。Bellagamba等［47］利用生物電化學(xué)技術(shù)有效解決了這一難題，在被污染的沉積物中放入一定尺寸的陽極，再利用2 V的低壓電解海水驅(qū)動氧氣的產(chǎn)生，實驗結(jié)果與對照組相比顯示，烴類的生物降解大大加快。這項技術(shù)表明，電解驅(qū)動的生物修復(fù)可以作為管理沉積污染物的有效方法。

此外，表面活性劑起到分散作用，在各種石油污染治理中受到高度關(guān)注。Yongrui等［48］對模擬近海水域石油泄漏進(jìn)行生物修復(fù)，并比較化學(xué)分散劑和生物表面活性劑的效果差異，實驗表明，鼠李糖脂對石油烴的生物修復(fù)效果遠(yuǎn)高于商品化生產(chǎn)的化學(xué)分散劑，且對降解石油烴的微生物沒有毒害作用。在寒冷地區(qū)，石油的降解較為緩慢。針對這種現(xiàn)象，Karppinen等［49］研究在生物炭加入的情況下，寒冷地區(qū)污染土壤中的石油碳?xì)浠衔锝到馇闆r，實驗結(jié)果顯示，與肥料（尿素和磷酸一銨）組對照相比，生物炭的加入提高了冷凍土壤中降解污染物的速率。

另一方面，微生物也可以用于石油的開采過程中。主要是采用向油層中注入微生物的方式，通過微生物降解原油產(chǎn)生的酸溶解灰質(zhì)膠結(jié)物、產(chǎn)生的氣體增加油田壓力并降低油的黏稠度、產(chǎn)生的表面活性劑乳化原油，這種方法緩解了傳統(tǒng)的用水加壓開采油田的方式，也避免了二次污染的發(fā)生［50］?，F(xiàn)有研究表明，微生物降解技術(shù)應(yīng)用十分廣泛，依然有待開發(fā)。

5 生物修復(fù)的前景

石油污染生物修復(fù)技術(shù)現(xiàn)已取得顯著的進(jìn)步。新的生物電化學(xué)技術(shù)方法已經(jīng)開始用于降解石油類污染物，有效強(qiáng)化了石油烴的厭氧生物降解［51］。芬頓氧化與微生物聯(lián)合法經(jīng)過實驗研究證明，土著菌去除石油烴效率可以顯著提高［52］。生物修復(fù)相對于物理、化學(xué)修復(fù)已經(jīng)取得明顯的工程技術(shù)優(yōu)勢，但其自身依然存在著諸多的問題。如（1）降解機(jī)理和影響因素有待進(jìn)一步深入分析；（2）需要篩選更多的高效降解菌和更好地理解微生物菌群之間的代謝合作關(guān)系；（3）在修復(fù)過程中存在的問題比如修復(fù)周期長、易受環(huán)境影響、難以實現(xiàn)廢物資源化亟待解決。基于此，石油烴污染生物修復(fù)今后可以在3個方面開展深入研究。

應(yīng)該加強(qiáng)新技術(shù)及其應(yīng)用研究。生物電化學(xué)技術(shù)可以在一定程度上幫助解決環(huán)境污染問題，并能將石油烴污染物轉(zhuǎn)化為氫能、電能，實現(xiàn)廢物資源化利用，但該技術(shù)依然有提高的地方，具體涉及到電極材料優(yōu)化、電解液pH衡定、陽極微生物種類和群落及電子傳遞介質(zhì)的進(jìn)一步研究。

提高微生物對石油的降解效率。可以利用分子生物學(xué)技術(shù)來構(gòu)造具有高效降解性能的基因工程菌，如利用整合分子雜交技術(shù)、DNA改組技術(shù)、基因組學(xué)技術(shù)將生物表面活性劑產(chǎn)生基因和各種烴類的降解基因整合到一種微生物體內(nèi)，來構(gòu)造出一種萬能的超級石油烴降解菌。但受限于基因工程微生物禁止商業(yè)用途，因此研究各種石油烴降解微生物對不同種類烴的降解能力及其篩選純化依然是今后的重點。

生物降解石油的機(jī)制還需進(jìn)一步明確。石油降解酶催化過程、降解歷程、降解過程中生物協(xié)同效應(yīng)等仍需要通過研究以確定所有機(jī)理，找到關(guān)鍵控制因子，進(jìn)而提高降解效率。具體涉及到的研究工作包括微生物體內(nèi)降解酶的種類和降解效率，石油生物降解前通過處理改變其結(jié)構(gòu)，以及提高脫氫、羥化和過氧化反應(yīng)過程的速率條件等。