向萍霞 張池 胡晞江 汪明

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢兒童醫(yī)院（武漢市婦幼保健院）（武漢430016）；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（武漢430060）

妊娠不足28周、胎兒體重不足1 000 g而終止者，稱為流產(chǎn)，發(fā)生在妊娠12周前者稱為早期流產(chǎn)。胚胎著床后31%發(fā)生自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA），其中80%為早期流產(chǎn)［1］，有2次及2次以上流產(chǎn)經(jīng)歷的被稱為復(fù)發(fā)流產(chǎn)（recurrent miscarriage，RM）。染色體異常是自然流產(chǎn)最常見的原因［2］，45%～70%的偶發(fā)性流產(chǎn)是基因異常引起的，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的比例為25%～57%［3］。微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）是一種高效的全基因組范圍分析拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）的分子診斷工具，被認(rèn)為是傳統(tǒng)細(xì)胞核型分析的有力替代工具［4］，并且無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，分辨率高。將aCGH芯片應(yīng)用于臨床檢測流產(chǎn)絨毛，國內(nèi)外都有文獻(xiàn)報(bào)道［5-8］，應(yīng)用該技術(shù)除了可以檢測出染色體異常外，還可以檢測出微缺失和微重復(fù)序列，也就是拷貝數(shù)變異（CNVs）。

有文獻(xiàn)報(bào)道SA組和RM組在染色體異常（類型和組成）的遺傳背景上有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［9］，他們的研究只采用的傳統(tǒng)的細(xì)胞核型分析，由于方法學(xué)的限制，有可能漏掉一些未檢測出的異常，我們采用Affimetrix公司的CytoScan optima全基因組芯片，對120例臨床診斷的早期自然流產(chǎn)及復(fù)發(fā)流產(chǎn)的絨毛組織進(jìn)行檢測，旨在更全面的探討早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的遺傳背景差異。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2016年6月至2017年12月間在武漢市婦幼保健院就診的患者，收集不明原因早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)組織物120例，孕周6～12周?；颊吣挲g22～41歲，平均（31.28±5.17）歲，孕次1～4次。早期流產(chǎn)組58例，復(fù)發(fā)流產(chǎn)組62例，患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 Array-CGH檢測方法應(yīng)用Affimetrix公司的CytoScan optima全基因組芯片掃描技術(shù)檢測全基因組CNVs。按試劑盒說明書操作，先后加入20 μL Protease K溶液、200 μL樣本和200 μL緩沖液AL，震蕩混勻后56℃溫育10 min，加入200 μL無水乙醇，漂洗2次；加入配制好的消化試劑消化，隨后加入配制的連接試劑連接，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增、提純、定量，加入片段化試劑進(jìn)行DNA片段化處理；將DNA溶液標(biāo)記后加入雜交試劑95℃10 min后，49℃孵育至少10 min，加200 μL 處理好的樣本載入到芯片中，置于密閉雜交盒中50℃16～18 min進(jìn)行雜交反應(yīng)；洗染芯片后掃描分析。用Affimetrix GeneChip Scaner生成原始文件，通過AGCC軟件芯片圖像顯示分析，利用軟件Affimetrix Chromosome Analysis SuiteSoftware分析結(jié)果。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的遺傳背景統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用χ2檢驗(yàn)（Fisher′s確切概率法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)軟件是SPSS 19.0。

2 結(jié)果

2.1 Array-CGH基因分析結(jié)果120例早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)絨毛樣本全部成功獲得芯片檢測結(jié)果，成功率100%。檢測出異常染色體67例，異常率為55.8%（67/120）。其中以非整倍體為最多，共62例，檢出率為51.7%（62/120）。CNVs有7例，檢出率為5.8%（7/120），其中單純性CNVs 4例，非整倍體合并CNVs 2例。還檢出1例單親二倍體（UPD）。芯片結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 120例流產(chǎn)絨毛array-CGH基因芯片分析結(jié)果Tab.1 Array-CGH results of 120 cases choronic villus samples例

2.2 早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的芯片結(jié)果差異比較（按年齡分組）將120例早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)絨毛樣本的芯片檢測結(jié)果按照年齡分組，進(jìn)行組間結(jié)果的詳細(xì)比較，在各組間均未發(fā)現(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，見表2。

3 討論

3.1 絨毛染色體微陣列比較基因組雜交檢測成功率高傳統(tǒng)的流產(chǎn)絨毛檢測方法由于受細(xì)胞污染的影響，有的樣本絨毛細(xì)胞無法成功貼壁，檢測成功率不高，筆者實(shí)驗(yàn)室的檢出率為51.9%［10］。Array-CGH芯片可以直接對流產(chǎn)絨毛提取DNA進(jìn)行檢測，不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，成功率為100%。

3.2 全基因組拷貝數(shù)變異（CNVs）微陣列比較基因組雜交技術(shù)（array-based comparative genomic hybridization，array-CGH）是近幾年開始在臨床上應(yīng)用的一種高效的分子核型分析技術(shù)，無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，直接提取DNA樣本進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異（copy number variants，CNVs）檢測，并將變異準(zhǔn)確定位到染色體上，達(dá)到基因水平檢測。CNVs是指在人類基因組中廣泛存在的從1 000堿基對（base pairs，bp）到數(shù)百萬bp范圍的缺失、插入、重復(fù)和復(fù)雜多位點(diǎn)的變異，表現(xiàn)為二倍體重復(fù)或者三倍體重復(fù)以及缺失。重復(fù)或缺失的CNVs可改變基因的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而對其表達(dá)產(chǎn)生影響，可能引起相應(yīng)的病理表型。CNVs目前分為致病性CNVs、非致病性CNVs以及臨床意義不明確的CNVs三類。本研究中所采用的Affymetrix公司的芯片是全球唯一通過FDA/CFDA/CE認(rèn)證的基因芯片掃描系統(tǒng)，本研究采用的CytoScan optima全基因組芯片總共包含315 608個探針，覆蓋對照、拷貝數(shù)（copy number，CN）和單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）探針。其中總共有180，18個CN和148 450個SNP標(biāo)記，在基因組中均勻分布，并重點(diǎn)加密了396個產(chǎn)前相關(guān)的基因區(qū)域。通過SNP和非多態(tài)性探針的結(jié)合，此芯片可應(yīng)用于產(chǎn)前及流產(chǎn)物樣本中CNVs的檢測，等位基因不平衡的檢出等。本研究中檢測出異常染色體67例，異常率為55.8%（67/120）。其中以非整倍體為最多，共62例，檢出率為51.7%（62/120）。CNVs有7例，檢出率為5.8%（7/120）。其中有位于DiGeorge Syndrome疾病區(qū)域的致病性 CNVs［11］；有臨床意義不明確［12］，位于Xp22.31區(qū)的1.68 Mb片段重復(fù)，該片段也有報(bào)道為可引起嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?3］等幾種CNVs?？傮w來看，本研究檢測出的變異率比李穎等［5］報(bào)導(dǎo)的比例（10/43）低，可能是因?yàn)樗麄兊难芯恐邪捞サ臉颖?。GAO等［4］對早期自然流產(chǎn)的絨毛染色體進(jìn)行了常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、FISH和aCGH檢測的方法學(xué)比對研究，他們報(bào)道在100例樣本中，培養(yǎng)失敗14例，F(xiàn)ISH和aCGH檢測成功率都是100%，他們只檢測出1例CNVs。其余結(jié)果中 16-三體、21-三體、18-三體、22-三體以及45，X單體、性染色體異常的三倍體等的檢出率和本研究都比較相似。他們認(rèn)為微小突變在他們的研究結(jié)果中比例不高，可能是由于有些微小突變并無致死性。SHEN等［14］對436例絨毛樣本進(jìn)行aCGH和第二代測序的全基因組對比研究，他們測出的CNVs比例為5.3%（23/436），和我們的結(jié)果5.8%是比較接近的。邢長英等［15］通過高通量基因測序技術(shù)對胚胎停育行清宮術(shù)的絨毛組織進(jìn)行分析，認(rèn)為流產(chǎn)組織中，微重復(fù)占81.3%，微缺失僅占18.8%，提示胚胎染色體的微重復(fù)可能更容易影響胚胎早期發(fā)育，導(dǎo)致妊娠早期的胚胎停育。本研究中檢測出1例單親二倍體（uniparental disomy，UPD），是同源染色體來自同一親體的情況。UPD在人群中的發(fā)生率大概為1/3 500［16］。對于UPD，即使采取常規(guī)培養(yǎng)制片成功，核型報(bào)告只能報(bào)告46，XX，不能檢測出異常，只能用分子遺傳學(xué)方法予以診斷和分析。本研究中有1例臨床診斷為“胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩”的樣本，經(jīng)芯片檢測全基因組范圍內(nèi)未見明顯基因缺失?！疤簩m內(nèi)發(fā)育遲緩”現(xiàn)稱“胎兒宮內(nèi)生長受限”，有母體和胚胎兩方面因素影響，本研究中只涉及一例，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本進(jìn)行深入探討。

表2 早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的芯片結(jié)果差異比較（按年齡分組）Tab.2 Comparison of distribution of genomic results in SA and RM by maternal age 例（%）

3.3 早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的遺傳背景無顯著性差別CHOI等［9］在2014年對自然流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)和核型分析的報(bào)道認(rèn)為：自然流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的細(xì)胞遺傳學(xué)背景存在顯著差異。他們的研究由于采用的是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)和核型分析，因而在文章中已經(jīng)說明一部分培養(yǎng)失敗的案例沒有納入。另外，他們的報(bào)道中孕周范圍包括20周的絨毛，納入病例的孕周范圍比本研究廣。他們的研究中也報(bào)道10周以內(nèi)的早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的細(xì)胞遺傳背景差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究采用基因芯片的檢測方法，對12周以內(nèi)的早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的分子遺傳背景進(jìn)行檢測，認(rèn)為無差異性，和CHOI等的研究結(jié)論基本一致。

綜上所述，array-CGH可直接對流產(chǎn)物提取DNA進(jìn)行檢測，克服了傳統(tǒng)核型分析細(xì)胞培養(yǎng)失敗，中期染色體制備不理想等缺點(diǎn)，對于UPD也能檢測出來，為臨床咨詢流產(chǎn)原因提供了一種更有效地遺傳學(xué)檢測方法。HARDY等［17］通過文獻(xiàn)檢索分析比較了FISH、CGH、SNP、qPCR、QF-PCR等分子遺傳學(xué)方法，認(rèn)為在培養(yǎng)失敗時，aCGH是最好的選擇。MASSALSKA等［3］也直接指出array-CGH芯片檢測是目前臨床檢測流產(chǎn)絨毛是否存在基因異常最有效的方法。本研究采用array-CGH芯片對12周以內(nèi)的早期流產(chǎn)和復(fù)發(fā)流產(chǎn)的分子遺傳背景進(jìn)行檢測，認(rèn)為沒有顯著差異，因?yàn)檠芯恐锌偣布{入120例病例，CNVs的檢出率不高，可以下一步擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的研究。