吳玨堃 熊志勇 阮瑩 劉宇

1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲狀腺乳腺外科（廣州510630）；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院普外科（廣州510630）

乳腺癌是女性最常見、病死率最高的惡性腫瘤之一［1］。乳腺癌的發(fā)生與遺傳、激素影響、生活方式等因素相關(guān)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，涉及多條信號(hào)通路。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer）是一種侵襲性乳腺癌亞型，指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）均表達(dá)陰性的乳腺癌分子分型，其病理分期更差、患者生存率更低［2］。與激素陽性乳腺癌相比，現(xiàn)有的化療及靶向治療方案對(duì)三陰性乳腺癌作用有限［3］。

Notch信號(hào)通路是一種進(jìn)化上高度保守的通路，在胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)維持過程中起著至關(guān)重要的作用。異常的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與多種人類遺傳病以及腫瘤生物學(xué)的多個(gè)方面有關(guān)，包括干細(xì)胞更新、癌細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移［4］。研究表明Notch信號(hào)通路可調(diào)控乳腺癌及乳腺癌干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡［5］，Notch信號(hào)作為許多疾病的潛在治療靶點(diǎn)得到了越來越多的關(guān)注，針對(duì)Notch信號(hào)通路的靶向治療藥物也有可能給乳腺癌的治療帶來新方向。

目前對(duì)Notch信號(hào)通路中的DLL1基因在乳腺癌中的表達(dá)及作用鮮有報(bào)道，本研究通過腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，研究DLL1在乳腺癌及三陰性乳腺癌中的表達(dá)差異的臨床意義及對(duì)預(yù)后生存的影響，為進(jìn)一步研究DLL1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索和思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料收集利用Bioconductor/TCGAbiolinks函數(shù)包從TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga）下載并預(yù)處理乳腺癌及三陰性乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier Plotter（http：//kmplot.com/analysis/index.php？p=service&cancer=breast）在線分析DLL1與乳腺癌及三陰性乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.2 數(shù)據(jù)集的篩選和臨床資料參數(shù)相關(guān)性研究提取TCGA數(shù)據(jù)集中乳腺癌及三陰性乳腺癌病例中的臨床參數(shù)和生存資料數(shù)據(jù)。根據(jù)DLL1表達(dá)量的資料，將數(shù)據(jù)按照中位數(shù)二等分，分別設(shè)為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)和方差分析，基因表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Pearson卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DLL1基因在乳腺癌和三陰性乳腺癌中的表達(dá)利用TCGA的數(shù)據(jù)我們分析了DLL1基因在113例正常乳腺組織、1 090例乳腺癌及66例三陰性乳腺癌中mRNA的表達(dá)情況（圖1），DLL1在乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)水平為2.28±0.07，明顯低于正常乳腺組織的相對(duì)表達(dá)水平3.83±0，14（t=7.471，P＜0.01）。DLL1在三陰性乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)水平為2.07±0.24，明顯低于正常乳腺組織的相對(duì)表達(dá)水平（t=6.789，P＜0.01）。DLL1在乳腺癌中的相對(duì)表達(dá)水平與三陰性乳腺癌的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.773，P=0.44）。

圖1 DLL1基因在乳腺癌和三陰性乳腺癌中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of DLL1 gene in breast cancer and triplenegative breast cancer

2.2 DLL1表達(dá)與臨床病理資料相關(guān)性在乳腺癌中，DLL1的表達(dá)與ER、PR、年齡、病理組織類型的相關(guān)性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與HER2、絕經(jīng)、種族、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在三陰性乳腺癌中，DLL1的表達(dá)與年齡、病理組織、絕經(jīng)、種族、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（表1）。

2.3 DLL1表達(dá)與乳腺癌及三陰性乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性為分析DLL1的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性，本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了乳腺癌DLL1 mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)腫瘤患者生存時(shí)間數(shù)據(jù)，利用Kaplan-Meier Plotter對(duì)這些腫瘤的數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DLL1的表達(dá)與乳腺癌患者的總生存期（HR=0.65、P=0.018）（圖2）、無病生存期（HR=0.59、P＜0.001）（圖3）有相關(guān)性，DLL1表達(dá)越低，乳腺癌患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間更短。在三陰性乳腺癌中，由于總生存期數(shù)據(jù)較少無法統(tǒng)計(jì)分析，DLL1的表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的無病生存期（HR=1.77、P=0.038）有相關(guān)性（圖4），在三陰性乳腺癌患者中，DLL1表達(dá)越低，乳腺癌患者無病生存時(shí)間更長。

3 討論

Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結(jié)合蛋白、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)節(jié)分子等組成。哺乳動(dòng)物有4種Notch受體（Notch1～4）和5種Notch配體（Delta-like 1，3，4，Jagged1和Jagged2）［7］。Notch 信號(hào)通路在進(jìn)化上十分保守，存在于許多動(dòng)物體內(nèi)。Notch位于細(xì)胞信號(hào)通路的交匯點(diǎn)，通過受體與配體的相互作用傳遞細(xì)胞信號(hào)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用。包括癌癥在內(nèi)的許多人類疾病，都存在Notch信號(hào)的調(diào)控錯(cuò)誤［8］。

表1 DLL1表達(dá)與乳腺癌及三陰性乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性Tab.1 Correlation between DLL1 expression and clinicopathological features of breast cancer and triple-negative breast cancer 例

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中Notch信號(hào)通路發(fā)揮了重要的作用，其中DLL1在肺癌［9］、胰腺癌［10］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［11］等多種腫瘤中表達(dá)異常，但DLL1在乳腺癌中的作用如何目前研究較少。

乳腺干細(xì)胞在乳腺發(fā)育及乳腺癌的發(fā)生中起著重要作用，研究表明乳腺干細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的DLL1，DLL1與Notch2和Notch3受體的結(jié)合對(duì)保持乳腺細(xì)胞處于干細(xì)胞狀態(tài)及其微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞數(shù)量至關(guān)重要，同時(shí)DLL1的表達(dá)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞表達(dá)Wnt3、Wnt10和Wnt16基因，這種發(fā)生在乳腺干細(xì)胞微環(huán)境中的“Notch-Wnt交談”對(duì)乳腺發(fā)育是至關(guān)重要的，這種機(jī)制也可能對(duì)乳腺癌產(chǎn)生，因?yàn)樵谌橄侔┲羞@些信號(hào)傳導(dǎo)通路的活性異常增加［12］。

圖2 DLL1表達(dá)對(duì)乳腺癌總生存期影響Fig.2 Effect of DLL1 expression on overall survival of breast cancer

圖3 DLL1表達(dá)對(duì)乳腺癌無病生存期影響Fig.3 Effect of DLL1 expression on breast cancer free survival

圖4 DLL1表達(dá)對(duì)三陰性乳腺癌無病生存期影響Fig.4 Effect of DLL1 expression on three negative breast cancer free survival

本研究利用TCGA的數(shù)據(jù)分析了DLL1基因乳腺癌中mRNA的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)DLL1在乳腺癌及三陰性乳腺癌中均均明顯低于正常乳腺組織。進(jìn)一步結(jié)合臨床病理資料分析，發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，DLL1在不同ER、PR、年齡、病理組織類型的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在不同HER2、絕經(jīng)、種族、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在三陰性乳腺癌中，DLL1在年齡、病理組織、絕經(jīng)、種族、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生存分析顯示DLL1表達(dá)越低，乳腺癌患者總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間更短，但是在三陰性乳腺癌患者中，DLL1表達(dá)越低，乳腺癌患者無病生存時(shí)間更長。雌激素受體、孕激素受體的相關(guān)性預(yù)示著DLL1在三陰性乳腺癌中的可能發(fā)揮的不同的作用機(jī)制，在三陰性乳腺癌中，低表達(dá)DLL1反而無病生存期更差，表明DLL1在三陰性乳腺癌的復(fù)發(fā)機(jī)制中可能有所不同。

現(xiàn)有的研究對(duì)DLL1的功能了解很少，本文通過生物信息學(xué)分析為DLL1基因的功能學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。本研究的不足之處在于TCGA數(shù)據(jù)庫提供的是mRNA表達(dá)水平的數(shù)據(jù)，不能完全替代蛋白水平的表達(dá)情況，后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步在臨床樣本中綜合mRNA和組織蛋白層面驗(yàn)證DLL1的表達(dá)情況，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中檢測DLL1表達(dá)差異對(duì)乳腺癌功能的有無影響。綜上所述，DLL1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中有著密切相關(guān)性，對(duì)其深入的研究可進(jìn)一步揭示其在乳腺癌中的功能及作用機(jī)制，深入的研究可為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的思路。