劉凱歌 吳方雄 衛(wèi)銀銀 閔亞莉 苗向霞 羅正奇

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（西安 710077）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第六大常見腫瘤，其病死率占癌癥第二位［1］。而乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是我國HCC的主要原因。研究［2］表明HBV DNA X基因編碼的乙肝病毒X蛋白（hepatitis B virus X protein，HBx）在乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。人血管生成素樣蛋白4（angiopoietin-like 4，ANGPTL4）是一種分泌型糖蛋白，在脂肪和肝臟組織中分布較多［3］，研究［4-5］發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。乙肝相關(guān)性肝癌中HBx與ANGPTL4的關(guān)系如何，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本文通過研究HBx和ANGPTL4在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)及HepG2-X中ANGPTL4的蛋白水平，探討其對乙肝相關(guān)性肝癌的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料69例乙肝相關(guān)性肝癌組織標(biāo)本由西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院病理科提供，均為2014年1月至2017年1月經(jīng)手術(shù)切除病例，術(shù)前均未行放、化療及其他輔助治療。人正常肝細(xì)胞株QZG、肝癌細(xì)胞HepG2及HepG2-X為空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，其中HepG2-X為轉(zhuǎn)染了HBx基因的HepG2細(xì)胞。鼠抗人HBx單克隆抗體（美國NeoMarkers公司），兔抗人ANGPTL4多克隆抗體、小鼠單克隆抗體GAPDH及蛋白Marker（英國Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測SP法檢測按常規(guī)步驟進(jìn)行，鼠抗人HBx單克隆抗體滴度1∶400，兔抗人ANGPTL4多克隆抗體滴度1∶200。以磷酸鹽緩沖液作為陰性對照，用已知陽性標(biāo)本作為陽性對照。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，依據(jù)每個(gè)視野中陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)弱進(jìn)行評分：僅對細(xì)胞核著藍(lán)色者為陰性，胞膜、胞漿或胞核呈棕黃色者為陽性。陽性細(xì)胞＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強(qiáng)陽性。兩項(xiàng)之和≤3分為陰性，＞3分為陽性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)人正常肝細(xì)胞株QZG、肝癌細(xì)胞株HepG2及HepG2-X細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清和青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，置37℃、0.5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 Western blot檢測收集對數(shù)生長期細(xì)胞后常規(guī)裂解，收集上清，95℃蛋白變性、定量及電泳。利用SDS-PAGE分離目標(biāo)蛋白。電泳后轉(zhuǎn)膜，100 g/L脫脂奶/TBS緩沖液封閉；兔抗人ANGPTL4抗體滴度1∶1 000，小鼠抗GAPDH抗體滴度1∶2 000，4℃孵育過夜；洗滌，HRP-標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，洗滌，ECL顯色，X線膠片感光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以±s表示，兩均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，兩變量之間采用Spearman等級相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBx和ANGPTL4在乙肝相關(guān)性肝癌組織的表達(dá)及相關(guān)性免疫組化檢測HBx和ANGPTL4在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)（圖1），69例乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx陽性表達(dá)率為68.11%（47/69），ANGPTL4陽性表達(dá)率為63.76%（44/69）；HBx陽性組ANGPTL4的陽性表達(dá)率76.95%（36/47）明顯高于HBx陰性組ANGPTL4的陽性表達(dá)率36.35%（8/22）（P ＜ 0.05）；Spearman相關(guān)分析表明，HBx與ANGPTL4的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.31，P ＜0.01）。

圖1 免疫組化檢測HBx和ANGPTL4在乙肝相關(guān)性肝癌組織的表達(dá)（SP，×400）Fig.1 Expression of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinoma were detected by immunohistochemistry（SP，× 400）

2.2 乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx及ANGPTL4表達(dá)與肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)HBx及ANGPTL4在乙肝相關(guān)性肝癌組織中陽性表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤直徑、包膜浸潤無關(guān)，而與門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P＜0.05）；其中TNM分期Ⅰ/Ⅱ期組病例中，HBx陽性表達(dá)率為60.46%（26/43），顯著低于Ⅲ/Ⅳ期組的80.76%（21/26）（P ＜ 0.05）；TNM分期Ⅰ/Ⅱ期組病例中，ANGPTL4陽性表達(dá)率為58.13%（25/43），顯著低于Ⅲ/Ⅳ期組的73.07%（19/26）（P ＜ 0.05）。見表1。

2.3 Western blot結(jié)果在HepG2-X中，ANGPTL4蛋白表大水平與轉(zhuǎn)染空載體的肝癌細(xì)胞HepG2及人正常肝細(xì)胞系QZG相比顯著升高（圖2）。

3 討論

HCC是高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤，但發(fā)生機(jī)制仍不明確。其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段、多因素和多分子參與的復(fù)雜過程。流行病學(xué)和分子生物學(xué)認(rèn)為HBV感染是HCC發(fā)生的高危因素，其中HBV中X基因編碼的HBx被認(rèn)為是乙肝相關(guān)性肝癌中重要的多功能病毒調(diào)控蛋白，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡在HCC的發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成中發(fā)揮著重要的作用［2，6］。研究［7］發(fā)現(xiàn)，HBx通過激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號通路與腫瘤微環(huán)境中的肝星狀細(xì)胞、免疫細(xì)胞、炎性因子及細(xì)胞外液相互作用，促進(jìn)HCC的發(fā)生進(jìn)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。HCC具有雙重血液供應(yīng)系統(tǒng)，是典型的富血供的惡性腫瘤。它的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)離不開新生血管的生成。盡管目前在肝癌血管生成方面的研究取得了很大的突破，但主要針對單個(gè)血管生成相關(guān)分子的作用，沒有進(jìn)行系統(tǒng)或網(wǎng)狀研究。本課題組前期工作提示HBx與HCC新生血管生成關(guān)系密切，參與的肝癌血管生成，并與多種血管生成的細(xì)胞因子相關(guān)［8-10］。本課題組前期通過基因芯片技術(shù)篩選出HBx參與肝癌血管生成的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)643條差異表達(dá)基因，其中UBR3、ATXN3、ANGPTL4等19條基因經(jīng)HBx干預(yù)后表達(dá)量明顯上升，F(xiàn)OLR1、HSPs、ZNF等624條明顯下降，提示HBx可能對ANGPTL4在肝癌血管生成中具有調(diào)節(jié)作用［10］。因此，本研究選擇二者作為研究因子。ANGPTL4屬于血管生成素樣蛋白家族一員，與腫瘤細(xì)胞的生長、遷移、浸潤和血管生成密切相關(guān)，促進(jìn)癌細(xì)胞血管通道形成，為腫瘤提供血供。ANGPTL4在舌鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌及乳腺癌中的血清水平或組織表達(dá)較對照組明顯升高［11-15］。同樣在肝癌患者中，ANGPTL4 mRNA表達(dá)和蛋白水平較高，敲除或中和ANGPTL4明顯抑制肝癌MHCC-97細(xì)胞轉(zhuǎn)移，因此，ANGPTL4與肝癌的生長、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。

表1 HBx及ANGPTL4表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship of HBx and ANGPTL4 in HBV related hepatocellular carcinomawith clinicopathological characteristics 例

圖2 Western blot檢測人QZG肝細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和HepG2-X細(xì)胞中ANGPTL4的表達(dá)Fig.2 The expression of ANGPTL4 in QZG，HepG2 and HepG2-X were detected by Western blot

本研究中，乙肝相關(guān)性肝癌組織中HBx陽性率為68.11%，ANGPTL4陽性率為63.76%，HBx陽性組ANGPTL4的陽性表達(dá)率明顯高于HBx陰性組ANGPTL4的表達(dá)率（P＜0.05）；相關(guān)性分析表明二者呈正相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HBx和ANGPTL4表達(dá)與門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。其中，TNM分期高的乙肝相關(guān)性肝癌中HBx和ANGPTL4的表達(dá)均較高（P＜0.05）。說明二者可能在乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及血管生成中發(fā)揮著協(xié)同作用。有研究表明肝癌組織中ANGPTL4的mRNA表達(dá)和蛋白水平較高，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤惡性度與ANGPTL4的表達(dá)密切相關(guān)［16］。而筆者通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，HepG2-X中ANGPTL4蛋白水平較人正常肝細(xì)胞系QZG及肝癌細(xì)胞HepG2顯著升高。本課題組前期通過transwell共培養(yǎng)技術(shù)也發(fā)現(xiàn)［17］，HBx促進(jìn)了ANGPTL4的表達(dá)，二者均提示在乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展中，ANGPTL4高表達(dá)與HBx相關(guān)；HBx可能通過促進(jìn)ANGPTL4的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，ANGPTL4高表達(dá)反映其預(yù)后不良。

因此，HBx和ANGPTL4表達(dá)上調(diào)可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要生物事件，與乙肝相關(guān)性肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，二者呈正相關(guān)，HBx可能通過正向調(diào)控ANGPTL4的表達(dá)，誘導(dǎo)乙肝相關(guān)性肝癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，而HBx調(diào)控ANGPTL4的具體信號通路有待進(jìn)一步研究。