羅程 陳琪 方程 羅斌 蘇松 夏先明 李波

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科（四川瀘州 646000）

膽管纖維化作為導(dǎo)致膽管狹窄的主要原因之一，是一種嚴(yán)重的病理過程。目前研究發(fā)現(xiàn)Hic-5（hydrogen peroxide-inducible clone5）基因參與了多種纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如腎小球硬化、增生性視網(wǎng)膜病變等，其可以通過對TGF-β1進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)組織纖維化的發(fā)生［1-6］。TGF-β1作為機(jī)體致纖維化最主要的細(xì)胞因子之一，當(dāng)大鼠膽管發(fā)生纖維化時，其表達(dá)水平顯著升高［7］。那么，在纖維化的膽管組織中Hic-5的蛋白表達(dá)情況如何，與TGF-β1是否存在著相互調(diào)控關(guān)系，有待于進(jìn)一步的研究。因此，本項目通過對大鼠纖維化膽管組織中Hic-5和TGF-β1的蛋白表達(dá)情況以及兩者的相互關(guān)系進(jìn)行研究，探討纖維化膽管中Hic-5的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 材料隨機(jī)選取30只SD大鼠（4～6周齡，體質(zhì)量200～400 g），平均分為手術(shù)組（膽管持續(xù)鉗夾90 min），假手術(shù)組（僅解剖分離膽管）和正常組。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集3組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)21 d后予以脫頸處死，腹部脫毛處理并沿腹中線原切口處切開腹壁（開口約5 cm），逐層分離皮下組織、肌肉和部分粘連，充分暴露十二指腸上段，探查見一淡黃色液體（膽汁）充盈的管道即為膽管，并于肝臟乳頭葉側(cè)鈍性分離并裸化膽管，在肝臟和十二指腸入口處之間切取膽管組織（長約3.5 cm）。

1.2.2 標(biāo)本檢測步驟（1）將離體的大鼠膽管組織進(jìn)行固定劑（4%多聚甲醛）固定并脫水，常規(guī)石蠟包埋切片并進(jìn)行抗原修復(fù)；（2）采用Masson染色法進(jìn)行組織中的纖維染色，明確纖維化的膽管組織；（3）免疫組織化學(xué)法進(jìn)行膽管組織中Hic-5和TGF-β1的抗原染色；（4）將離體膽管組織研碎，并加入RAPI裂解液進(jìn)行組織裂解，離心后取上清進(jìn)行蛋白變性，并通過蛋白印跡法檢測纖維化膽管組織中Hic-5和TGF-β1的表達(dá)。

1.2.3 觀察指標(biāo)及結(jié)果判斷（1）Masson染色：膠原纖維將被苯胺藍(lán)試劑染為藍(lán)色條索，膽管纖維化時，膽管周圍將呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色條索結(jié)構(gòu)即為纖維組織；（2）免疫組織化學(xué)法：目的蛋白的陽性表達(dá)將出現(xiàn)黃褐色的染色，膽管纖維化時，觀察Hic-5和TGF-β1在膽管組織中的陽性表達(dá)及分布；（3）蛋白印跡法：半定量的檢測目的蛋白的表達(dá)情況，膽管纖維化時，觀察Hic-5和TGF-β1的條帶灰度值情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，分析方法為one-way ANOVA，檢測水平α=0.05，結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行表示，P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。指標(biāo)間的相關(guān)性采用Pearson法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Masson染色結(jié)果藍(lán)色的纖維條索結(jié)構(gòu)主要分布于手術(shù)組的膽管組織中，而正常組和假手術(shù)組相對較少（圖1，F(xiàn)=91.69，P ＜0.001）。手術(shù)組的纖維化程度（藍(lán)色纖維結(jié)構(gòu)表達(dá)量）明顯大于正常組和假手術(shù)組（P＜0.001），雖然假手術(shù)組的纖維化程度略高于正常組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖2）。

圖1 膽管組織的Masson染色Fig.1 The Masson test of bile duct tissue

2.2 免疫組化結(jié)果

2.2.1 Hic-5的免疫組化結(jié)果陽性染色顆粒主要分布于手術(shù)組的膽管組織中，并圍繞于膽管上皮細(xì)胞，而假手術(shù)組和正常組均只有少量表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3，F(xiàn)=587.7，P ＜0.001）。手術(shù)組的陽性染色（黃褐色表達(dá)量）明顯高于正常組與假手術(shù)組（P＜0.001），雖然假手術(shù)組的陽性表達(dá)程度略高于正常組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4，P ＞ 0.05）。

圖2 各組間膽管纖維化相對面積比Fig.2 Relative area rate of bile duct fibrosis between groups

2.2.2 TGF-βl的免疫組化結(jié)果陽性染色顆粒集中表達(dá)于手術(shù)組的膽管組織中，表達(dá)區(qū)域?qū)捛叶啵浬⒂谀懝苌掀ぜ?xì)胞間，而假手術(shù)組和正常組均只有少量散在的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5，F(xiàn)=561.1.7，P ＜ 0.001）。手術(shù)組的陽性染色（黃褐色表達(dá)量）明顯高于正常組與假手術(shù)組（P＜0.001），雖然假手術(shù)組的陽性表達(dá)程度略高于正常組，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖6，P ＞ 0.05）。

2.2.3 Hic-5和TGF-βl的免疫組化結(jié)果相關(guān)性分析手術(shù)組的Hic-5和TGF-βl免疫組化表達(dá)量變化采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析顯示r=0.989 8，P＜0.001，表明Hic-5和TGF-β1在纖維化的膽管組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。

圖3 膽管組織的Hic-5免疫組化檢測Fig.3 The immunohistochemistry test of Hic-5 inbile duct tissue

圖4 各組間Hic-5光密度值比較Fig.4 Comparison of Hic-5 optical density values between groups

2.3 Hic-5和TGF-βl的蛋白表達(dá)Hic-5和TGF-βl于3組中的相對蛋白表達(dá)量分別為正常組（0.81±0.11，0.93±0.05），假手術(shù)組（0.75±0.08，0.84±0.13），手術(shù)組（1.48 ± 0.04，1.25 ± 0.04）（圖7）。手術(shù)組的膽管組織中的Hic-5和TGF-βl蛋白表達(dá)顯著高于正常組和假手術(shù)組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），雖假手術(shù)組和正常組間存在差異，但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）（圖8、9）。

2.4 Hic-5和TGF-βl的蛋白印跡法結(jié)果相關(guān)性分析手術(shù)組的Hic-5和TGF-βl相對蛋白表達(dá)量變化采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析顯示r=0.776 4，P＜0.01，表明Hic-5和TGF-β1的相對蛋白表達(dá)在纖維化的膽管組織中的呈正相關(guān)關(guān)系。

圖5 膽管組織的TGF-βl免疫組化檢測Fig.5 The immunohistochemistry test of TGF-βl inbile duct tissue

圖6 TGF-βl光密度值比較Fig.6 Comparison of TGF-βl optical density values

圖7 正常組、假手術(shù)組和手術(shù)組的膽管組織Hic-5和TGF-βl western blot結(jié)果Fig.7 Western blot results of Hic-5 and TGF-β1 in biliary tissues of normal group，sham group and model group

3 討論

圖8 Hic-5的western blot比較Fig.8 Western blot comparison of Hic-5

圖9 TGF-βl的western blot比較Fig.9 Western blot comparison of TGF-βl

膽管纖維化是由于膽管組織損傷后以膽管上皮為中心的炎癥和纖維化反應(yīng)，并伴有進(jìn)行性膽汁淤積，膽管增生，并最終導(dǎo)致膽管硬化狹窄和纖維化的一種病理性修復(fù)，進(jìn)而誘發(fā)肝組織纖維化［8-9］。作為纖維化疾病中最為重要的細(xì)胞因子之一的TGF-βl，研究發(fā)現(xiàn)其在多種纖維化疾病中呈現(xiàn)顯著的表達(dá)升高［10-14］。此外，研究還證實(shí)了在肝癌的發(fā)生中，TGF-βl是一個重要的誘導(dǎo)因素，可以增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險，這可能與TGF-βl參與肝纖維化的發(fā)生有著密切的關(guān)系［15］。膽管作為機(jī)體主要的管道器官組織之一，其對肝膽管系統(tǒng)的穩(wěn)定發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。但對于膽管組織纖維化疾病的研究卻相對較少。本研究通過鉗夾法致膽管梗阻進(jìn)而引起膽管纖維化，手術(shù)組膽管呈現(xiàn)明顯的纖維化狀態(tài)。在手術(shù)組的膽管組織中，通過免疫組化檢測分析顯示TGF-β1的陽性表達(dá)明顯升高，表達(dá)區(qū)域?qū)捛叶?，并彌散于膽管上皮?xì)胞間，相較于正常組和假手術(shù)組均具有顯著的差異。同時將3組膽管組織進(jìn)行半定量的蛋白印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)手術(shù)組的TGF-β1陽性表達(dá)條帶明顯寬于正常組和假手術(shù)組，而且其灰度值也明顯升高。因此，筆者推斷TGF-β1可能促使了大鼠膽管組織纖維化的發(fā)生，如果能夠干預(yù)TGF-β1的表達(dá)則可能緩解膽管纖維化，進(jìn)而改善膽管狹窄。目前研究發(fā)現(xiàn)，在增生修復(fù)的瘢痕組織中，Hic-5激活了TGF-βl，并促進(jìn)了組織的瘢痕修復(fù)過程。當(dāng)Hic-5被敲除或沉默后，TGF-βl的表達(dá)和分泌就會顯著的降低［16-17］。但對于膽管組織，目前尚無Hic-5基因的相關(guān)研究，因此，能夠明確Hic-5基因在膽管組織纖維化疾病中的作用機(jī)制對進(jìn)一步的了解膽管纖維化的發(fā)生發(fā)展過程具有重要的價值和意義。本研究發(fā)現(xiàn)在膽管組織明顯纖維化的手術(shù)組中，Hic-5的免疫組化陽性表達(dá)顯著升高，主要分布于膽管細(xì)胞周圍，同時蛋白印跡法也顯示出手術(shù)組膽管組織的Hic-5蛋白表達(dá)量明顯高于正常組和假手術(shù)組。此外，對免疫組化和蛋白印跡法的檢測結(jié)果進(jìn)行Pearson法相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Hic-5和TGF-βl存在明顯的正相關(guān)關(guān)系，說明在纖維化的膽管組織中，兩者可能存在某種互相調(diào)控關(guān)系，共同導(dǎo)致了膽管纖維化的發(fā)現(xiàn)。但本研究缺乏對Hic-5和TGF-βl的增強(qiáng)或者沉默來進(jìn)一步的驗(yàn)證該結(jié)果，這也將是下一步進(jìn)行的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在纖維化的膽管組織中，Hic-5和TGF-βl的表達(dá)均顯著升高，膽管纖維化的發(fā)生與Hic-5和TGF-βl有著密切的關(guān)系。與此同時，Hic-5和TGF-βl在纖維化的膽管組織中呈正相關(guān)關(guān)系，說明兩者可能共同促進(jìn)了膽管纖維化的發(fā)生。筆者的發(fā)現(xiàn)對進(jìn)一步明確膽管纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為從根本上改善各種原因所致的膽管狹窄提供了新的研究方向。