張鴻毅 趙剛剛 李華鋒 肖克兵 崔潔

西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1泌尿外科，2腫瘤科（西安710077）；3西安醫(yī)學院全科醫(yī)學院（西安 710077）

前列腺癌是一種雄激素依賴性腫瘤，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移主要通過雄激素信號途徑來進行。雄激素阻斷是前列腺癌的主要治療方法之一。雖然大部分患者對初始治療敏感，但遺憾的是，在18～24個月以后卻出現(xiàn)雄激素抵抗和生化復發(fā)［1-3］。因此，提高前列腺癌對內(nèi)分泌治療的敏感性是一項重要的研究課題。富含亮氨酸的三角狀五肽重復結(jié)構(gòu)蛋白（leucine rich pentatricopeptide repeat containing，LRPPRC）是一種線粒體蛋白，在維持氧化磷酸化活性中發(fā)揮重要作用［4-6］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LRPPRC促進前列腺癌細胞線粒體凋亡，本課題在體外水平進一步研究下調(diào)LRPPRC是否可以增強前列腺癌細胞對雄激素阻斷治療的敏感性，探討LRPPRC是否可以成為一個分子靶標，克服雄激素抵抗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株人前列腺癌細胞株LNCaP和DU145均購于中科院上海生命科學研究院細胞中心。10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胰蛋白酶購自上海亨代勞商貿(mào)有限公司；四甲基偶氮唑鹽購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒購自北京華肽先鋒生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Caspase-3小鼠抗人單克隆抗體、Bcl-2兔抗人單克隆抗體、Bax兔抗人單克隆抗體均購自美國Abcam公司；LRPPRC兔抗人單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染實驗取對數(shù)生長期細胞，提前1 d將細胞鋪在6孔板中，調(diào)整細胞密度為30%～50%/孔，每孔約0.4×106個細胞。配置轉(zhuǎn)染試劑，10 μL OligofectaminTM、10 μL LRPPRC siRNA（10 μmol/L）與80 μL RPMI 1640培養(yǎng)基混合。在每孔加入已配置好的轉(zhuǎn)染試劑。48 h完成轉(zhuǎn)染。LRPPRC siRNA靶序列見表1。

表1 LRPPRC siRNA靶序列Tab.1 Sequences of LRPPRC siRNA

1.2.2 MTT法取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，使細胞密度為5 000個/孔，待細胞貼壁后進行藥物干預，24 h終止培養(yǎng)，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO，避光條件下震蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測OD490 nm吸光值，計算細胞存活率，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測凋亡將對數(shù)生長期細胞接種于六孔板，待細胞貼壁后進行藥物干預，24 h終止培養(yǎng)，胰酶消化、收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為（0.5～1）×106/mL，PBS洗2遍，分別加入AnnexinV-FIT、PI和Binding Buffer，在室溫下避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復實驗3次。

1.2.4 Western blot檢驗首先提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，制作SDS-PAGE凝膠，蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜，滴加一抗，4℃孵育過夜，室溫下二抗孵育1 h，ECL化學發(fā)光反應，Quantity One 4.62凝膠圖像掃描，試驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 下調(diào)LRPPRC顯著增強LNCaP細胞對比卡魯胺的敏感性在LNCaP和DU145中轉(zhuǎn)染siRNA LRPPRC，48 h后藥物干預。分為4個處理組，包括對照組、比卡魯胺組、siRNA LRPPRC組和比卡魯胺+siRNA LRPPRC組。比卡魯胺設置10、50和100 μmol/L 3種劑量。24 h干預結(jié)束，終止培養(yǎng)。MTT法檢測各組細胞存活率。結(jié)果顯示，比卡魯胺顯著抑制LNCaP細胞增殖，藥物濃度增高和處理時間延長，細胞存活率顯著降低（P＜0.05），對DU145細胞增殖無顯著抑制作用（圖1）。與對照組、比卡魯胺組、siRNA LRPPRC組比較，比卡魯胺（50 μmol/L或100 μmol/L+siRNA LRPPRC顯著抑制LNCaP細胞增殖。在DU145中未觀察到下調(diào)LRPPRC對比卡魯胺的顯著增敏作用（圖2）。

圖1 比卡魯胺對前列腺細胞增殖抑制作用Fig.1 The anti-proliferation effect of bicalutamide in prostate cancer cells

圖2 不同處理組對前列腺癌細胞的增殖抑制作用Fig.2 The anti-proliferation effects of different treatments in prostate cancer cells

2.2 下調(diào)LRPPRC顯著增強比卡魯胺誘導的LNCaP細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測前列腺癌細胞凋亡率。結(jié)果顯示：在LNCaP細胞中，50 μmol/L比卡魯胺+siRNA LRPPRC組細胞凋亡率顯著增高（27.9%）（P ＜ 0.05），10 μmol/L比卡魯胺+siRNA LRPPRC組的凋亡率（7.3%）與siRNA LRPPRC組（6.9%）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在DU145細胞中未觀察到下調(diào)LRPPRC增強比卡魯胺誘導的凋亡。說明下調(diào)LRPPRC促進高劑量比卡魯胺誘導的激素敏感性前列腺癌細胞凋亡（圖3）。

圖3 前列腺癌細胞不同處理組凋亡率Fig.3 The apoptosis rates of prostate cancer cells with different treatments

2.3 LRPPRC對前列腺癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響Western blot法檢測前列腺癌細胞凋亡相關蛋白的表達。比卡魯胺+siRNA LRPPRC組pro-Caspase-3表達降低，cleaved Caspase-3表達增高，Caspase-3活化水平增高。比卡魯胺增強LNCaP細胞Bcl-2蛋白表達，下調(diào)LRPPRC降低被比卡魯胺增強的Bcl-2蛋白表達（圖4）。與siRNA LRPPRC組比較，DU145細胞比卡魯胺+siRNA LRPPRC組Caspase-3活化水平無明顯增強，比卡魯胺對DU145細胞Bcl-2和Bax蛋白表達無明顯影響（圖5、6）。

3 討論

癌細胞通過調(diào)節(jié)線粒體功能適應各種壓力，使細胞產(chǎn)生凋亡抵抗，從而對抗腫瘤藥物耐受。目前研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白家族介導的線粒體凋亡異常是癌細胞對凋亡抵抗的原因之一［7-8］。

LRPPRC是調(diào)節(jié)線粒體氧化磷酸化活性的重要蛋白。近期研究［9-12］發(fā)現(xiàn)在多種類型的腫瘤組織中LRPPRC呈高表達狀態(tài)，而在周圍正常組織中幾乎不表達。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織LRPPRC高表達，LRPPRC和Bcl-2表達有顯著正相關性［13］，LRPPRC可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2表達，影響前列腺癌細胞線粒體凋亡［14］。本研究進一步探討了LRPPRC對雄激素受體拮抗劑敏感性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在激素依賴性前列腺癌細胞中，下調(diào)LRPPRC使比卡魯胺的增殖抑制和凋亡誘導作用增強，并且這種作用是與劑量有關的，即對50 μmol/L比卡魯胺有增敏作用，而對10 μmol/L無顯著增敏作用。既往研究發(fā)現(xiàn)比卡魯胺通過增強Bcl-2蛋白的表達獲得凋亡抵抗，而對比卡魯胺耐藥［15］。本研究發(fā)現(xiàn)比卡魯胺使Bcl-2表達增高，下調(diào)LRPPRC降低被比卡魯胺增強的Bcl-2表達。在激素抵抗性前列腺癌細胞中，我們未發(fā)現(xiàn)下調(diào)LRPPRC對比卡魯胺的增敏作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)比卡魯胺對DU145細胞Bcl-2/Bax蛋白表達無顯著影響，而LRPPRC對凋亡的影響是通過調(diào)節(jié)Bcl-2水平實現(xiàn)的，因此我們認為，下調(diào)LRPPRC可能通過抑制被比卡魯胺增強的Bcl-2表達來增敏比卡魯胺。

圖4 LNCaP細胞不同處理組Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達Fig.4 The Caspase-3，Bcl-2，Bax protein expressions in LNCaP cells with different treatments

圖5 DU145細胞不同處理組Caspase-3蛋白表達Fig.5 The Caspase-3 protein expressions in DU145 cells with different treatments

圖6 比卡魯胺對DU145細胞Bcl-2/Bax蛋白表達的影響Fig.6 The Bcl-2/Bax protein expressions in DU145 cells with bicalutamide

誘導癌細胞凋亡一直是腫瘤治療領域的重要方向［16］。雄激素受體拮抗劑通過誘導凋亡抑制前列腺癌生長。但是，癌細胞在低雄激素信號的微環(huán)境中，會逐漸產(chǎn)生凋亡抵抗。癌細胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白逃離藥物誘導的凋亡。抑制LRPPRC表達使抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低，癌細胞對雄激素受體拮抗劑的敏感性增強。因此，LRPPRC可能成為一個分子靶標，增強激素依賴性前列腺癌對雄激素受體拮抗劑的敏感性，降低耐藥克隆出現(xiàn)的機率，延緩生化復發(fā)時間，改善預后。但當腫瘤進展為激素抵抗時，抑制LRPPRC表達對雄激素受體拮抗劑無增敏作用。因此，在臨床上聯(lián)合應用雄激素受體拮抗劑和針對LRPPRC的分子靶向藥物時，要選擇合適的獲益人群。