姜楊 李永濤 徐桂清 郭林娜 張彧婷 沈雷 姚立杰 王玉

（1齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（3齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)教研室 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

引言

目前，組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，早已成為許多學(xué)者研究的熱點，但組織工程學(xué)修復(fù)損傷肌腱的研究還是很少。肌腱損傷治療還停留在傳統(tǒng)的治療手段上，如縫合、移植等，治療后也會出現(xiàn)肌腱重復(fù)斷裂，對患者造成精神和身體上一定痛苦。隨著組織工程技術(shù)的開展，有些學(xué)者提出組織工程手段修復(fù)損傷肌腱，為治療肌腱損傷提供一個新的治療方法。姜任武等[1]將MSCs培養(yǎng)在支架上，放于跟腱損傷部位，8周后復(fù)合物與肌腱融合，無瘢痕形成。本實驗研究選取的種子細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，支架材料為PLGA高分子材料。

骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是目前組織工程最理想的種子細胞，獲得容易，來源于骨髓，屬于來源發(fā)育早期中胚層一類成體干細胞，優(yōu)點具有多向分化性特性和自我更新能力，其取材方便，能在體外貼壁、增殖生長的細胞。很多學(xué)者通過實驗研究得出間充質(zhì)干細胞在一定誘導(dǎo)條件下可以分化成軟骨細胞、成骨細胞、成脂肪細胞，促進損失組織愈合作用[2]。目前研究乳酸-乙醇酸（PLGA）是目前理想的生物組織支架材料，其特點具有生物相容性、降解性好以及較好的力學(xué)性能，應(yīng)用在納米醫(yī)學(xué)范疇內(nèi)[3]。在高分子生物支架上加入緩釋一定濃度趨化因子SDF-1，趨化因子是細胞因子家族中小分子蛋白質(zhì)，具有趨化作用的[4]。SDF-1（又稱CXCL12），屬于趨化家族中的一員，有學(xué)者研究：與配體CXCR4結(jié)合成生物軸，形成CXCL12∕CXCR4軸，其軸是調(diào)控間充質(zhì)干細胞向損傷部位遷移發(fā)揮重要作用[5]。CXCL12∕CXCR4軸同時增加間充質(zhì)干細胞生存活性及增殖等作用[6]。本實驗通過組織工程手段研究趨化因子SDF-1復(fù)合PLGA支架材料，觀察骨髓間充質(zhì)干細胞種植在復(fù)合支架上的增殖和趨化能力。

1.材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清（美國Gibco），DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone），青鏈霉素（美國Gibco），胰蛋白酶（Sigma 公司），4%多聚甲醛，大鼠SDF-1（美國Abcam），PLGA（上海聚睿生物公司）。

超凈工作臺，二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡（日本Olympus），Transwell小室（美國Corning），CCK-8試劑盒（碧云天）Emax 酶標(biāo)儀為（美國 Molecular Devices），高速離心機（德國Eppendorf），震蕩儀（躍進儀器廠），靜電紡絲機（SS-2535DC）。

1.2 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)：取2～4周齡SD大鼠（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物中心提供），體重100g左右，斷頸處死，分離股骨，無菌環(huán)境下處理取大鼠股骨兩端剪開，3mlPBS培養(yǎng)基沖洗骨髓腔1～2次，離心管收集細胞懸液1000r/s，離心5～10min，用槍頭吸出上清液，加入培養(yǎng)液，用培養(yǎng)液吹均勻離心管下層組織，放入25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，放入37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，12～24h觀察換液，觀察細胞培養(yǎng)瓶有霧狀細胞聚集，慢慢去除未貼壁細胞，之后每3d進行換液。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)、狀態(tài)，細胞長滿培養(yǎng)瓶底80%～90%進行消化和傳代，第三代間充質(zhì)干細胞應(yīng)用進行實驗研究。

1.3 聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料制備

將PLGA材料溶于六氟異丙醇和冰醋酸溶液中，制備3%比重聚合物溶液，在室溫下放在攪拌器上，用磁力棒攪拌，混勻，一般24小時左右。打開靜電紡絲機電源預(yù)熱，推注器選用2.5ml注射器，噴絲直徑0.5mm，速度0.6mL∕h，電極距離12cm，鋁箔接收后放入干燥箱內(nèi)，-80℃保存。

1.4 緩釋SDF-1的納米材料制備

殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，并進行紫外照射滅菌。

1.5 將BMSCs加入緩釋SDF-1的納米材料

將4×105個BMSCs滴加到緩釋SDF-1聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料上，37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 培養(yǎng)各組細胞（BMSCs對照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復(fù)合PLGA生物纖維肌腱+BMSCs組）24小時，提取各組細胞上清液。

1.7 CCK8實驗檢測各組BMSCs細胞增殖能力

按照CCK-8試劑盒說明書進行操作，取對數(shù)生長期的BMSCs細胞，取將第三代間充質(zhì)干細胞用胰蛋白酶消化1～2min，計數(shù)細胞，實驗組取1×105個MSC滴加到殼聚糖緩釋SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，對照組取1×105cells/mL密度直接接種于96孔板，每孔加入培養(yǎng)液200μL，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1天等待貼壁，給予換液，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別在第1天、3天、5天棄掉原培養(yǎng)液，加入CCK-8溶液10μl，培養(yǎng)4小時，使用酶標(biāo)儀在450nm波長下檢測各孔吸光度（OD值），取5孔平均值作為各組實驗結(jié)果。

1.8 Transwell實驗檢測各組細胞體外遷移的影響

按照Transwell試劑盒說明書進行操作，將第三代骨髓間充質(zhì)干細胞用0.25%胰蛋白酶消化1～2min，細胞計數(shù)器調(diào)整骨髓間充質(zhì)干細胞密度1×105個/mL，取細胞懸液200μL加入Transwell小室的上室，下室分別為500μLDMEM含120ng/ml濃度SDF-1因子復(fù)合PLGA上清液的培養(yǎng)液和含PLGA上清液的培養(yǎng)液，對照組為500μL的DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)3個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h，培養(yǎng)結(jié)束后4%多聚甲醛固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色20min，在倒置顯微鏡下觀察，每個復(fù)孔隨機選取5個視野進行拍照統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0軟件統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以（±s）表示，配對樣本進行t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 各組CCK-8細胞增殖實驗比較

BMSCs對照組、BMSCs+PLGA組、緩釋SDF-1復(fù)合PLGA材料+ BMSCs組，各組間充質(zhì)干細胞活性的影響。結(jié)果S-BP實驗組細胞活性比BP組細胞活性增強（P＜0.01），BP組細胞活性比正常對照組細胞活性增強（P＜0.05），具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表。

表 各實驗組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

表 各實驗組BMSCs吸光度(OD值)的比較（±s，n=3）

與正常對照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 1d 3d 5d正常對照組 0.49±0.03 0.62±0.02 0.68±0.01 BP 組 0.59±0.02* 0.71±0.05* 0.78±0.04*S-BP 組 0.68±0.03* 0.83±0.04** 0.89±0.02**

2.2 各組細胞Transwell遷移實驗比較

S-BP實驗組與正常對照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖。

圖 各實驗組BMSCs遷移數(shù)量作用的比較（±s，n=3）與正常對照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01。

3.討論

隨著現(xiàn)代體育運動熱潮的盛行，許多人都加入體育活動中。但是，由于鍛煉的方式不恰當(dāng)或者年齡限制等許多因素，導(dǎo)致肌肉、肌腱損傷或斷裂的病例越來越多。據(jù)統(tǒng)計全球報道每年超過3000萬肌腱損傷案例[7]。目前傳統(tǒng)的治療方式主要是理療、縫合以及自體或同種異體移植、人工合成材料等，但治療愈后效果不理想。隨著社會科技不斷進步，醫(yī)學(xué)治療手段飛速發(fā)展，近年來，許多研究者運用干細胞復(fù)合生物支架材料的組織工程手段，加速了損傷肌腱等組織愈合再生[8]。

本研究實驗的種子細胞是取材方便、成活率高的大鼠成體骨髓間充質(zhì)干細胞，BMSCs免疫原性低，分化能力強，是理想的組織工程種子之一。生物支架是生物相容性、降解性好和力學(xué)性能好的PLGA高分子材料，可以安全應(yīng)用于人體內(nèi)[9]。細胞因子也是組織工程不可缺少的重要組成部分，本實驗選擇在前期研究的趨化家族因子SDF-1，對間充質(zhì)干細胞有趨化作用，趨化因子SDF-1與CXCR4結(jié)合，激活下游蛋白，招募間充質(zhì)干細胞歸巢到損傷部位，參與修復(fù)組織。本實驗研究利用趨化因子殼聚糖緩釋120ng/ml濃度SDF-1到聚乳酸-乙醇酸納米高分子材料，再加入一定計數(shù)BMSCs放入支架進行聯(lián)合培養(yǎng)，來觀察BMSCs在復(fù)合SDF-1的PLGA材料支架上相容性和BMSCs增殖及遷移情況。實驗研究結(jié)果得出SDF-1因子和BMSCs可粘附在PLGA支架材料，說明PLGA支架材料無毒性；BMSCs在支架上形態(tài)呈梭形，生長情況較好，與PLGA支架材料相容性好。CCK-8增殖檢測S-BP實驗組細胞活性比BP組細胞活性增強（P＜0.01），BP組細胞活性比正常對照組細胞活性增強（P＜0.05）；Transwell細胞遷移實驗表明細胞遷移率S-BP實驗組與正常對照組比較有顯著性差別（P＜0.01），BP組與正常對照組相比較有明顯差別（P＜0.05）；復(fù)合SDF-1的PLGA支架材料可有效的使骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和遷移。進而我們可以推測出SDF-1趨化因子復(fù)合PLGA支架能夠使BMSCs增殖并且趨化使BMSCs至損傷肌腱位置，也參與損傷肌腱修復(fù)，也為下一步實驗的開展提供了實驗鋪墊。

綜上所述，利用組織工程技術(shù)促進肌腱組織修復(fù)已經(jīng)成為日益重視的研究領(lǐng)域，復(fù)合型生物肌腱材料促進損傷肌腱的修復(fù)、再生及血管化是目前很多學(xué)者即要解決的問題，本研究通過構(gòu)建復(fù)合SDF-1的PLGA材料支架有效趨化BMSCs遷移，但SDF-1趨化因子復(fù)合PLGA支架材料招募BMSCs歸巢的機制尚不清楚，還需進一步研究證實。