張玉霖 余海峰 周亮 張又枝（通訊作者） 陳錦紅

（湖北科技學院藥學院 湖北 咸寧 437100）

七葉一枝花(Paris polyphylla)為重樓屬多年生草本植被，屬十分珍貴的藥材，有悠久的藥用歷史，具有抗菌抑菌、止血消炎、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[1]。包括七葉一枝花在內(nèi)的重樓屬植物，其藥用成分主要為皂苷、黃酮類等物質[2]。黃酮類化合物具有抗病毒、抗氧化、預防心腦血管疾病、抗腫瘤、清除自由基等多方面的功用[3]。由于目前七葉一枝花常用根部入藥，而其地上的莖、葉部分常被丟棄，為更充分利用七葉一枝花的現(xiàn)有資源，測定其莖、葉不同部位總黃酮，給合理利用整株七葉一枝花提供理論依據(jù)。本文參考相關文獻[4-6]，選用蘆丁為對照，利用蘆丁和鋁的絡合物產(chǎn)生熒光的原理來測定七葉一枝花中總黃酮的含量，結果滿意。

1.材料與儀器

1.1 材料

七葉一枝花地上莖、葉，采購于長陽澤昊中藥材種植基地。蘆丁對照品（批號161223，購自上海圻明生物科技有限公司），硝酸鋁、乙酸鈉、甲醇、無水乙醇、乙酸等均為分析純。

1.2 儀器

RF-5301型熒光分光光度計(日本島津)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；萬分之一電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；DHG-9140B電熱恒溫鼓風干燥箱（上海培因實驗儀器有限公司）；FW177型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；LDZ4-0.8低速自動離心機（北京醫(yī)用離心機廠）、PHS-3C型PH計（上海雷磁精密科學儀器有限公司）；RE-5299旋轉蒸發(fā)儀（鄭州市亞榮儀器有限公司）。

2.方法與結果

2.1 七葉一枝花總黃酮的提取方法

將七葉一枝花地上莖、葉分開，除雜洗凈，烘干粉碎。按照文獻[7]方法，精密稱取莖、葉樣品粉末各一定量加石油醚脫脂脫色后揮干，按液料比15：1加入90%乙醇超聲提取30min，重復提取2次，合并提取液，以90%乙醇定容至50mL。

2.2 測定條件的選擇

精密稱取蘆丁對照品，用90%乙醇配成0.5g·L-1的標準溶液，移取該溶液液0.8mL至25mL容量瓶，加入10% Al（NO3）3溶液1.6mL、不同PH（2.7、3.6、4.5、5.4）的HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用不同體積分數(shù)（50%，70%，90%，100%）乙醇定容，搖勻?？疾煲掖俭w積分數(shù)、溶液PH對熒光測定的影響。在激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為5nm條件下掃描，測得激發(fā)波長=430nm，發(fā)射波長=483nm。

不同體積分數(shù)（50%，70%，90%，100%）乙醇的影響結果見圖1。圖1表明，配合物的熒光強度基本隨著乙醇體積分數(shù)增加而增強，且乙醇體積分數(shù)變大后，最大峰位略微向右移動。當乙醇濃度為90%時，熒光強度明顯強于其它濃度。所以，本實驗選定90%乙醇為測定溶劑。

圖1 不同濃度乙醇溶劑的影響

不同PH緩沖溶液的影響見圖2，隨著溶液PH值的升高，熒光強度值先增高后減弱?？梢姴煌琍H的溶液會影響配合物的穩(wěn)定性。當加入PH=3.6的緩沖溶液時，熒光強度最大，本實驗選擇加入PH=3.6的HAC-NaAC緩沖溶液。

圖2 不同PH的影響

2.3 標準曲線的繪制

分別吸取0.5g·L-1蘆丁標準溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.5mL于6只25ml容量瓶中，依次加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，最后用90%乙醇定容，即得蘆丁標準工作溶液。以試劑空白為參比，測定各蘆丁標準工作溶液的熒光強度，繪制標準曲線。結果表明，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1的范圍內(nèi)與熒光強度呈良好線性關系，回歸方程為Y=33573X-13.715，Y表示熒光強度，X表示蘆丁濃度，相關系數(shù)r2為0.9991。

2.4 精密度試驗

取同一份樣品溶液平行測定6次，測得溶液中總黃酮濃度分別為 18.742、18.695、18.377、18.421、18.869、18.471ug·L-1，RSD為0.19%，表明方法精密度良好。

2.5 加標回收試驗

為了驗證本法測定的準確性，在樣品溶液中加入蘆丁對照品進行考察。準確稱取樣品6份，再加入不同量蘆丁標準溶液，按樣品測定方法提取、測定，結果見表。該方法平均回收率為96.55%，說明該方法準確可行。

表 七葉一枝花總黃酮回收率試驗

2.6 樣品測定

精密量取“2.1”項下莖、葉提取液各一定量，分別加入10%Al（NO3）3溶液1.6mL及PH=3.6HAC-NaAC緩沖溶液0.8mL，用90%乙醇定容至25mL，測定各溶液熒光強度，代入回歸方程，求得莖、葉中總黃酮含量分別為4.86、6.12mg·g-1。

3.討論

本文采用熒光分光光度法測定七葉一枝花總黃酮含量，考察了乙醇溶劑體積分數(shù)、溶液PH等對熒光強度的影響。實驗表明，在本文實驗條件下，蘆丁濃度在0.004～0.03g·L-1范圍內(nèi)與熒光強度有良好的線性關系，平均回收率為96.55%。熒光法對比傳統(tǒng)的紫外分光光度法靈敏度更高，且操作簡單，可以作為測定七葉一枝花總黃酮含量的方法。樣品測定結果表明，七葉一枝花地上的莖、葉中含有豐富的黃酮類化合物，可以充分利用。