張曉艷 譚紅 周驄 聶敏海

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 四川 瀘州 646000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC，簡(jiǎn)稱口腔鱗癌)是位居第18的危害人類健康的惡性腫瘤[1]。希望通過體外模型或動(dòng)物模型來研究分析口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程，為其治療提供思路和依據(jù)。

口腔鱗癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)變和致病過程是復(fù)雜多變的。Hawkins等[2]發(fā)現(xiàn)，4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinoline-l-oxide，4NQO）飲水法誘導(dǎo)大鼠口腔黏膜癌變的過程與人口腔黏膜癌變過程相似，該大鼠模型的建立有利于研究人口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展。通過時(shí)間變量的影響，以期得到在屏障環(huán)境下，4NQO誘癌模型的較優(yōu)選擇。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

165只6周齡雄性SD大鼠(成都達(dá)碩生物有限公司提供)，體重約200～220g；屏障環(huán)境，室溫20～25℃，濕度40%～60%，燈光模擬自然循環(huán)。純凈無(wú)菌飲水和SPF級(jí)動(dòng)物專用滅菌固體飼料喂養(yǎng)(成都達(dá)碩生物有限公司提供)，系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)物品均經(jīng)消毒滅菌后傳送進(jìn)入；4NQO(Sigma公司,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SD大鼠165只，隨機(jī)分11組,每組15只。實(shí)驗(yàn)組1為A、B、C、D、E組，實(shí)驗(yàn)組2為A1、B1、C1、D1、E1組，F(xiàn)組為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)大鼠分別于第10周(A)、12周（A1）、14周(B)、15周（B1）、18周(C、C1)、21周（D1）、22周(D)、24周(E1)、26周（E、F）分9批處死。對(duì)照組F于26周同期處死。

1.2.2 制質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%的4NQO水溶液，4℃冰箱避光保存。飼育時(shí)稀釋為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.004%置遮光瓶?jī)?nèi)。對(duì)照組飲滅菌水置普通塑料瓶?jī)?nèi)。全組每周換水3次，瓶?jī)?nèi)殘余水做無(wú)害化廢棄處理。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 觀察大鼠的行為和精神狀態(tài)，每周稱重1次；2周觀察口腔黏膜情況，并記錄。

1.3.2 處死取舌、雙頰、腭、食道的黏膜和頸淋巴結(jié)、肝及脾的組織標(biāo)本，觀察標(biāo)本的組織病理學(xué)變化。蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色切片，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。病理分級(jí)為正常黏膜，上皮單純性增生，輕度、中度、重度上皮異常增生，口腔鱗癌。上皮異常增生的診斷參考世界衛(wèi)生組織2005年標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所獲病理分級(jí)數(shù)據(jù)用等級(jí)資料兩樣本的秩和檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)共獲得有效動(dòng)物模型156只，斗毆死亡2只，麻醉意外死亡1只，衰竭死亡6只。

2.2 SD大鼠進(jìn)入屏障環(huán)境2周后飲食飲水趨于正常。

2.3 觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組口內(nèi)均較清潔，舌色粉，柔軟富彈性，無(wú)肉眼可見改變。實(shí)驗(yàn)組從9周開始，舌逐漸出現(xiàn)粗糙不平，缺乏光澤，白色樣變，舌體萎縮、彈性降低。18周后口腔清潔較差,黏膜水腫，偶伴充血糜爛面、偶見新生物和潰瘍面。22周后發(fā)現(xiàn)部分大鼠頰部新生物，伴舌根潰瘍。各組全程均未出現(xiàn)大鼠口腔黏膜組織壞死。

2.4 大鼠模型病理分級(jí)結(jié)果如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)各組病理分級(jí)表

經(jīng)等級(jí)資料兩樣本的秩和檢驗(yàn)，示不同時(shí)間對(duì)模型的影響不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（當(dāng)ν→∞時(shí)，按α=0.05，Z=1.66,0.01＜P＜0.05）。

在收集的標(biāo)本中各階段病變占當(dāng)組的比例如表2所示，可知實(shí)驗(yàn)組1前期模型的成模率比重較高，而實(shí)驗(yàn)組2后期的成模率比重較理想。

表2 各階段病變?cè)诟鹘M中的比例

實(shí)驗(yàn)表3，各階段所得標(biāo)本總數(shù)占實(shí)驗(yàn)總數(shù)的比例，正常黏膜的數(shù)目最多，其余各階段數(shù)目基本一致。后期病理檢查發(fā)現(xiàn)，所有標(biāo)本中，2例食管鱗癌，1例淋巴轉(zhuǎn)移，未發(fā)現(xiàn)肝和脾等的明顯病理改變。

表3 各階段模型占模型總數(shù)的比例

3.討論

在常用的口腔鱗癌誘導(dǎo)劑4NQO和二甲基苯并蒽(10-dimethyl-1,2-benzanthracene,DMBA)間，因DMBA誘導(dǎo)的模型易出現(xiàn)組織炎癥反應(yīng)和壞死[4]，因此4NQO誘癌模型自出現(xiàn)[5]就被認(rèn)可，該大鼠模型對(duì)口腔鱗癌的研究有重要意義。本研究在屏障系統(tǒng)下用4NQO飲水法成功建立大鼠模型，將口腔鱗癌的連續(xù)過程展現(xiàn)，突顯了4NQO的誘癌作用。

實(shí)驗(yàn)中同一時(shí)間范圍內(nèi)，相同因素下飼養(yǎng)的大鼠可能有相似或相同的病理改變，但因個(gè)體差異使病變程度不一。隨時(shí)間推移，向癌轉(zhuǎn)變的概率增高，發(fā)展迅速。本研究說明在4NQO誘癌過程中，10周后開始出現(xiàn)各個(gè)階段病理改變，在24周后逐漸轉(zhuǎn)化為鱗癌。實(shí)驗(yàn)組1取材較早，間隔4周，獲得上皮單純性增生和輕度上皮異常增生的有效標(biāo)本較多，后期各階段的標(biāo)本稍不足。而實(shí)驗(yàn)組2的取材時(shí)間推遲，間隔3周，前期各階段有效標(biāo)本稍不足，中度、重度上皮異常增生和鱗癌標(biāo)本較均衡。經(jīng)秩和檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，總的來說實(shí)驗(yàn)組1的取材時(shí)間優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組2。在10周左右開始取材，綜合兩實(shí)驗(yàn)組的間隔時(shí)間，所得標(biāo)本可能各階段較均衡，但該方法有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

在舌癌早期會(huì)出現(xiàn)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)深度和轉(zhuǎn)移率與腫瘤的直徑、分級(jí)、生長(zhǎng)方式、分化程度是否有相關(guān)性尚有待研究[6]。口腔作為消化道起始，模型中未發(fā)現(xiàn)食管黏膜上皮異常增生，僅2例食管黏膜上皮癌，1例淋巴轉(zhuǎn)移?？紤]其可能原因是4NQO致癌有一定的靶向性；也可能是造模時(shí)間相對(duì)較短，口內(nèi)原發(fā)灶未轉(zhuǎn)移，但并不排除可能存在的隱匿性頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微轉(zhuǎn)移。阻斷轉(zhuǎn)移是癌前狀態(tài)到鱗癌的關(guān)鍵點(diǎn)，也是目前亟待解決的問題[7]。

總的來說，4NQO飲水法建立大鼠口腔鱗癌模型的方法較簡(jiǎn)便、靶器官較明確、病變典型，過程相對(duì)穩(wěn)定，癌變時(shí)間相對(duì)可控可循，整個(gè)過程與人口腔鱗癌的過程相似，該模型是研究口腔鱗癌的理想模型[8]，優(yōu)化該模型對(duì)研究口腔癌前病變、鱗癌的發(fā)生發(fā)展和鱗癌的治療預(yù)防都有深遠(yuǎn)意義[9]。