林壽凱 王軍義

廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院

由于內(nèi)耳結(jié)構(gòu)位于顳骨內(nèi)相對(duì)封閉，且與全身血液循環(huán)之間存在血-迷路屏障，因此經(jīng)全身給藥途徑進(jìn)入內(nèi)耳的藥物劑量極為有限，此外經(jīng)全身給藥也可能對(duì)身體其他器官造成不良反應(yīng)，而內(nèi)耳的局部給藥相比全身給藥具有高效，副作用小的特點(diǎn)[1]，故內(nèi)耳局部給藥越來越受到關(guān)注。內(nèi)耳局部給藥主要分為有創(chuàng)給藥和微創(chuàng)給藥，而有創(chuàng)給藥可能對(duì)外耳道和中耳造成永久性損害，故微創(chuàng)給藥具有廣泛的研究價(jià)值和應(yīng)用前景，其中圓窗給藥途徑是微創(chuàng)治療方法的重要選項(xiàng)。圓窗是通過局部給藥治療內(nèi)耳病變最重要的界面，研究表明不僅小分子藥物能滲透通過圓窗膜進(jìn)入耳蝸外淋巴液，微球粒徑為1μm時(shí)也能穿過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳，目前圓窗給藥方法尚處于實(shí)驗(yàn)階段，在臨床應(yīng)用之前，要克服的最重要的問題之一是開發(fā)針對(duì)目標(biāo)部位的藥物的智能送藥系統(tǒng)，并在內(nèi)耳中控制釋放[2]，實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的重要條件之一就是圓窗途徑藥物載體的研究和選擇。內(nèi)耳局部給藥的載體分為多種，包括病毒載體、納米粒載體、蛋白質(zhì)載體、原位凝膠等[2-4]?，F(xiàn)就內(nèi)耳藥物載體及圓窗途徑應(yīng)用的相關(guān)研究綜述如下。

1 病毒載體

病毒載體是利用病毒質(zhì)粒構(gòu)建目標(biāo)基因的載體，可轉(zhuǎn)染至目標(biāo)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因功能，是內(nèi)耳疾病基因治療研究的重要工具。病毒載體具有較好的靶向性和高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但同時(shí)病毒載體具有一定的局限性，如無法轉(zhuǎn)移大尺寸的基因，成本高等缺點(diǎn)[5]。常見的內(nèi)耳基因病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、慢病毒、單純皰疹病毒、牛痘病毒載體。

1.1 腺病毒載體

腺病毒是一種大分子雙鏈無包膜DNA病毒，它通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中；腺病毒載體是內(nèi)耳基因治療研究中最常用的病毒載體，基因容量為8000bp[6]，具有轉(zhuǎn)染效率高、低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)，Shu[7]等發(fā)現(xiàn)腺病毒載體能夠有效地在哺乳動(dòng)物內(nèi)耳中轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞類型，最常見的靶細(xì)胞是內(nèi)耳聽覺毛細(xì)胞和支持細(xì)胞，Staecker等[8]發(fā)現(xiàn)腺病毒載體能成功轉(zhuǎn)染包括聽覺毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞在內(nèi)的眾多內(nèi)耳細(xì)胞，Suzuki的研究[9]也有類似的發(fā)現(xiàn)，可見腺病毒載體雖然在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)染效率高，但特異性不強(qiáng)；Luebke等[10]研究發(fā)現(xiàn)重組腺病毒載體能轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞，且緩慢注入比快速注入更能提高對(duì)毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染率；Staecker等[8]在其研究中還發(fā)現(xiàn)腺病毒載體對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞的功能沒有明顯的損傷，表明腺病毒載體具有低細(xì)胞毒性；但腺病毒載體在進(jìn)入內(nèi)耳的過程大多是有創(chuàng)的，常見的方法包括耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺給藥，雖然圓窗穿刺途徑比耳蝸造口術(shù)創(chuàng)傷小、易操作，但其對(duì)外耳的創(chuàng)傷依然是臨床應(yīng)用所不能接受的；早在2001年Jero等[11]發(fā)現(xiàn)明膠海綿可以在鼓室輔助腺病毒載體無創(chuàng)透過圓窗進(jìn)入內(nèi)耳，但其操作依然對(duì)外耳道和中耳損傷嚴(yán)重。

1.2 腺相關(guān)病毒載體

腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV）是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，作為載體其基因容量為4000-5000bp[6]，根據(jù)AAV病毒衣殼的差異已確定了12種血清型(AAV-1～AAV-12)[12]，不同血清型AAV載體對(duì)內(nèi)耳轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞不同；在耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞方面，AAV-1、2、4、5、6、7、8和9的載體主要轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細(xì)胞，還可轉(zhuǎn)染Hensen細(xì)胞[13,14]，而AAV-3的載體只被發(fā)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染其他內(nèi)耳細(xì)胞[14]，其余類型的血清型（AAV-10、11、12）暫未發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染研究；此外，部分血清型（AAV-1～AAV9）[13-15]和重組腺相關(guān)病毒可轉(zhuǎn)染外毛細(xì)胞，但外毛細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率明顯低于內(nèi)毛細(xì)胞；目前利用AAV載體進(jìn)入內(nèi)耳的給藥途徑有耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺和跨圓窗膜給藥三種方式，研究發(fā)現(xiàn)利用腺相關(guān)病毒載體跨圓窗膜給藥比耳蝸造口術(shù)、圓窗穿刺給藥更安全，降低了損傷的發(fā)生幾率，且跨圓窗膜給藥也具有較高的轉(zhuǎn)染效率，只是目前跨圓窗膜給藥方式依然需要通過外科方式暴露圓窗。

1.3 慢病毒載體

慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體，屬于RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，基因容量為8000bp[6]，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體在內(nèi)耳的應(yīng)用研究[4,16]中表現(xiàn)出安全性好、轉(zhuǎn)染效率高、基因表達(dá)長期穩(wěn)定等特點(diǎn)，研究[4,17-19]發(fā)現(xiàn)慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)染大部分耳蝸細(xì)胞類型（包括內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、上皮細(xì)胞、支持細(xì)胞），并且發(fā)現(xiàn)慢病毒載體在內(nèi)耳轉(zhuǎn)染效率高，但特異性不強(qiáng)；Pietola L等[17]研究發(fā)現(xiàn)慢病毒引起的細(xì)胞炎癥反應(yīng)水平低，是一種安全的載體；目前慢病毒載體內(nèi)耳給藥途徑為耳蝸?zhàn)⑸洹⒖鐖A窗膜給藥的方式；陳文博[20]利用慢病毒載體跨圓窗膜轉(zhuǎn)導(dǎo)白細(xì)胞介素-10（IL-10）進(jìn)入內(nèi)耳，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體可在內(nèi)耳長期穩(wěn)定表達(dá)；慢病毒載體具有很好的應(yīng)用前景，但靶向性不強(qiáng)可能限制其使用范圍，而且它對(duì)外毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率低[16,19]。

1.4 單純皰疹病毒載體

單純皰疹病毒型載體，主要由I型單純皰疹病毒（HSV-1）改造而來，基因容量為30000bp[6]，是雙鏈線性DNA病毒載體，但單純皰疹病毒持續(xù)表達(dá)時(shí)間較短，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低；目前，單純皰疹病毒載體在內(nèi)耳給藥方式主要是以耳蝸?zhàn)⑸錇橹?，利用重組單純皰疹病毒載體經(jīng)注射給藥進(jìn)入耳蝸的研究中，主要轉(zhuǎn)染了成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、Hensen細(xì)胞、Deiters細(xì)胞[4]，研究發(fā)現(xiàn)重組單純皰疹病毒載體的細(xì)胞毒性較低，適合用作基因的長期載體；但是，Holt JR等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)單純皰疹病毒不能轉(zhuǎn)染毛細(xì)胞；目前，有關(guān)內(nèi)耳的研究中未發(fā)現(xiàn)該載體跨圓窗膜滲透給藥方式。

1.5 牛痘病毒載體

牛痘病毒的基因組很大，該載體安全性好，基因容量為25000bp[6]，具有快速復(fù)制和分解受感染的細(xì)胞、獲得高水平的病毒基因表達(dá)能力、傳播細(xì)胞到細(xì)胞的能力，牛痘病毒具有廣泛的感染宿主，因而是一種非常有效的DNA重組載體，且活動(dòng)不受缺氧和治療照射的影響[22]；Derby ML[4]等人利用耳蝸?zhàn)⑸涞姆绞綄⑴６徊《据d體轉(zhuǎn)移到豚鼠的耳蝸細(xì)胞中，得到減少毛細(xì)胞受到傷害的結(jié)果，并主要轉(zhuǎn)染了成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞，少量轉(zhuǎn)染內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞；牛痘病毒雖然已被應(yīng)用于內(nèi)耳研究中，但相關(guān)的研究報(bào)道比較少，不是內(nèi)耳研究的主要病毒載體。

綜上所述，病毒載體在內(nèi)耳研究中的應(yīng)用特點(diǎn)總結(jié)參考表1。

2 納米粒載體

納米粒是指粒徑在1～100 nm，藥物可以溶解、包裹于高分子材料中形成的載體，是一種納米級(jí)范疇的亞微粒藥物載體輸送系統(tǒng)，具有促進(jìn)藥物的持續(xù)釋放、靶向運(yùn)輸、增加被載藥物溶解度、改善藥物吸收等特點(diǎn)[23,24]，特別是納米?？梢詿o損滲透過圓窗進(jìn)入內(nèi)耳[25,26]，是一類很有應(yīng)用價(jià)值的內(nèi)耳藥物載體；目前用于內(nèi)耳藥物研究的納米粒主要有脂質(zhì)體納米粒載體、聚乳酸/乙醇酸納米粒載體（PLGA）。

2.1 脂質(zhì)體納米粒載體

脂質(zhì)體納米粒系指將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型泡囊體，粒徑分布于20-1000nm，可以與細(xì)胞膜融合而將藥物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入內(nèi)耳細(xì)胞后，脂質(zhì)體膜能夠自動(dòng)降解，故對(duì)細(xì)胞沒有毒性，具有極大的應(yīng)用前景，脂質(zhì)體納米粒載體被認(rèn)為是迄今為止最成功的細(xì)胞藥物載體系統(tǒng)[25]，Wareing等[27]1999年首次成功使用陽離子脂質(zhì)體作載體經(jīng)耳蝸?zhàn)⑸鋵⒒蜣D(zhuǎn)導(dǎo)入內(nèi)耳細(xì)胞，且研究未發(fā)現(xiàn)任何毒性或炎癥反應(yīng)，說明脂質(zhì)體可以作為內(nèi)耳給藥的安全載體，目前其作為內(nèi)耳藥物載體的研究比較多，研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體載體能將藥物成功轉(zhuǎn)運(yùn)至Claudius細(xì)胞、外毛細(xì)胞、內(nèi)柱細(xì)胞、外柱細(xì)胞等內(nèi)耳細(xì)胞[28]；目前，利用脂質(zhì)體納米粒作載體給藥進(jìn)入內(nèi)耳的途徑有鼓膜穿刺經(jīng)鼓室緩釋跨圓窗膜滲透給藥、耳蝸造口術(shù)和耳蝸穿刺給藥，鼓膜穿刺經(jīng)鼓室緩釋跨圓窗膜滲透給藥方法是將載藥納米粒通過鼓膜途徑注射至鼓室內(nèi)，納米粒由液相轉(zhuǎn)變成凝膠狀附著于圓窗外達(dá)到緩釋效應(yīng)，因此比耳蝸造口術(shù)和耳蝸穿刺創(chuàng)傷小、安全性高[25,28]。

2.2 聚乳酸/乙醇酸納米顆粒載體

聚乳酸/乙醇酸納米顆粒是一個(gè)帶電可生物降解乳酸和乙醇酸單體組成的共聚物，是聚合物納米顆粒，具有較高的穩(wěn)定性，較高的藥物運(yùn)載量等優(yōu)點(diǎn)，但水溶性較差；Ge等[29]利用聚乳酸/乙醇酸納米粒載體跨圓窗膜將超順磁性氧化鐵導(dǎo)入內(nèi)耳的內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞等內(nèi)耳細(xì)胞，說明聚乳酸/乙醇酸納米顆粒雖然轉(zhuǎn)運(yùn)效率高，但特異性不強(qiáng)；但Wen等[30]通過化學(xué)修飾聚乳酸/乙醇酸納米粒表面的親水基團(tuán)，提高載體的水溶性可以增加對(duì)外毛細(xì)胞的靶向性；目前，利用聚乳酸/乙醇酸納米顆粒作藥物載體進(jìn)入內(nèi)耳途徑有耳蝸?zhàn)⑸?、跨圓窗膜滲透給藥，但研究發(fā)現(xiàn)跨圓窗膜給藥比注射給藥更高效[31]。

3 原位凝膠

原位凝膠是一種局部的藥物輸送系統(tǒng)，它具有良好的生物相容性和生物可降解性，原位凝膠在內(nèi)耳藥物運(yùn)輸應(yīng)用廣泛，是一種特殊的內(nèi)耳藥物載體；利用原位凝膠將藥物經(jīng)鼓膜注射入中耳，在內(nèi)耳圓窗膜上形成儲(chǔ)層效應(yīng)，可有效控制藥物釋放進(jìn)入內(nèi)耳的速度，達(dá)到緩釋效果[32,33]。陳鋼等[34]研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用泊洛沙姆407制備的原位凝膠在低于25℃時(shí)為液態(tài)，在32℃時(shí)變?yōu)榘牍虘B(tài)，該特點(diǎn)可被利用于保護(hù)對(duì)溫度敏感的藥物運(yùn)輸；原位凝聚作為內(nèi)耳的藥物載體具有制備工藝簡單、毒副作用小、持續(xù)控制藥物釋放和微創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)[35]，但無法控制藥物進(jìn)入內(nèi)耳后的生物行為，對(duì)內(nèi)耳細(xì)胞的靶向性差。

表1 耳蝸不同輸送病毒載體的特點(diǎn)比較Table 1 cochlear delivery of different viral vector comparison

4 蛋白質(zhì)載體

目前，利用蛋白質(zhì)作載體將藥物運(yùn)送進(jìn)入內(nèi)耳的相關(guān)研究極少，Qi等[36]利用破傷風(fēng)抗毒素（TAT）與雙鏈RNA結(jié)合域構(gòu)建了一種特殊的siRNA載體（TAT doublestranded RNA-binding domains，TAT-DRBDs），通過外科手術(shù)暴露圓窗，利用蛋白TAT-DRBDs結(jié)合siRNA成功跨圓窗膜滲透進(jìn)入內(nèi)耳，并成功導(dǎo)入到內(nèi)毛細(xì)胞、外毛細(xì)胞等內(nèi)耳細(xì)胞，而且不具有細(xì)胞毒性，該研究為內(nèi)耳基因藥物載體實(shí)驗(yàn)開拓了新的思路。

綜上所述，內(nèi)耳局部給藥系統(tǒng)構(gòu)建是解決內(nèi)耳疾病最具應(yīng)用前景的方式，該系統(tǒng)的構(gòu)建目前面臨的主要問題是創(chuàng)傷性，而圓窗膜的可滲透性為微創(chuàng)內(nèi)耳給藥系統(tǒng)的構(gòu)建提供了基礎(chǔ)，如以固體脂質(zhì)體納米和原位凝膠為載體的內(nèi)耳藥物系統(tǒng)就可以通過鼓膜穿刺鼓室儲(chǔ)藥緩釋透過圓窗膜進(jìn)入內(nèi)耳，達(dá)到微創(chuàng)的目的；病毒載體是內(nèi)耳疾病基因治療的重要工具，但目前尚無發(fā)現(xiàn)微創(chuàng)性的內(nèi)耳輸送方法，這也是需要研究的方向。