王明利，馮琦，賈一松，馬武勃，劉亞民

糖尿病足（DF）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在世界范圍內(nèi)有著極高發(fā)病率[1]。糖尿病足患者的皮膚傷口愈合緩慢，嚴(yán)重者可能需要截肢，給患者健康造成嚴(yán)重威脅[2]。糖尿病可改變患者的血管生成，白細(xì)胞浸潤，巨噬細(xì)胞功能，細(xì)胞外基質(zhì)沉積和成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生物學(xué)過程，對(duì)傷口愈合的各個(gè)階段（凝血，炎癥，再上皮化和重塑）都產(chǎn)生一定的影響[3,4]。盡管創(chuàng)面愈合的過程十分復(fù)雜，但是調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等多種生長(zhǎng)因子，恢復(fù)血運(yùn)重建是目前糖尿病足治療的重要手段[5,6]。

糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織愈合過程中，血管生成起著關(guān)鍵作用。多種信號(hào)通路被VEGF，血小板衍生生長(zhǎng)因子，血管生成素，Notch，Wnt和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β等細(xì)胞因子激活，其中又以VEGF作為主要參與者[7]。VEGF-A是血管生成的主要介質(zhì)，主要激活酪氨酸激酶受體VEGF受體-2（VEGFR-2）。而非受體酪氨酸激酶SRC（一種膜結(jié)合的非受體酪氨酸激酶）則是上述幾種生長(zhǎng)因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要下游，其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括磷脂酰肌醇-3-激酶，粘著斑激酶和促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），對(duì)血管生成調(diào)控具有重要意義[8]。

經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴(kuò)張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)是已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于糖尿病足大血管重建的治療方法，但其對(duì)VEGF等血管生長(zhǎng)因子的影響還不明確，為探究血管腔內(nèi)成形術(shù)對(duì)VEGF/VEGF-R2/SRC功能軸的影響，協(xié)助術(shù)后療效的預(yù)測(cè)和評(píng)估，我科自2015年1月～2017年12月采用經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴(kuò)張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)治療糖尿病足患者，觀察其療效，血管腔內(nèi)成形術(shù)治療對(duì)糖尿病足患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組選擇2015年1月～2017年12月于寶雞市中醫(yī)醫(yī)院確診為糖尿病足的患者137例，其中男性69例，女性68例，年齡38～75（42.3±6.1）歲。所有患者依據(jù)WHO制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]確診為2型糖尿病，患者均以足部感染或潰瘍不愈為主要癥狀來院就診，并伴不同程度的足部皮膚麻涼、疼痛、間歇性跛行等癥狀，各類檢查證實(shí)患肢動(dòng)脈有變形、狹窄或閉塞，血流速度減慢。本研究征得患者及其家屬同意，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過實(shí)施。將患者隨機(jī)分為手術(shù)組69例和對(duì)照組68例。手術(shù)組男性36例，女性33例；年齡43～74（53.1±11.2）歲；糖尿病病程3.4～22.6（16.8±3.9）年；糖尿病足病程23～248（52.6±15.3）d；Wagner分級(jí)：Ⅰ級(jí)23例，Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)6例；對(duì)照組男性34例，女性34例；年齡45～74（53.7±11.3）歲；糖尿病病程2.9～23.1（16.1±5.1）年；糖尿病足病程32～254（51.6±14.2）d；Wagner分級(jí)：Ⅰ級(jí)21例，Ⅱ級(jí)20例，Ⅲ級(jí)19例，Ⅳ級(jí)8例。兩組患者一般資料比較無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法對(duì)照組患者嚴(yán)格執(zhí)行糖尿病飲食和胰島素降血糖、采集病變部位分泌物病原菌培養(yǎng)，根據(jù)藥敏結(jié)果選擇有效抗生素控制感染，局部清創(chuàng)及換藥等常規(guī)治療；手術(shù)組在對(duì)照組治療方法的基礎(chǔ)上，采取經(jīng)皮腔內(nèi)球囊擴(kuò)張形成術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)的治療方法，局麻成功后，經(jīng)股動(dòng)脈順行或脛后動(dòng)脈逆行穿刺，成功后造影顯示病變動(dòng)脈，注入肝素鈉3000 u，導(dǎo)絲穿過閉塞或狹窄動(dòng)脈，以球囊進(jìn)行擴(kuò)張，若擴(kuò)張后血管開通率＜70%，則置入金屬支架。膝關(guān)節(jié)以下病變動(dòng)脈只采取球囊擴(kuò)張，不進(jìn)行支架置入治療。

1.2.2 創(chuàng)面愈合率測(cè)定患者于入組時(shí)、治療第2、4周，對(duì)足背創(chuàng)面拍照，測(cè)定創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。愈合率（%）=（1-目前創(chuàng)面面積/入組時(shí)創(chuàng)面面積）×100%。

1.2.3 患肢血管功能測(cè)定患者于入組時(shí)及治療第4周后，以彩色多普勒超聲診斷儀檢測(cè)治療前后內(nèi)膜中層厚度、收縮期血管峰值血流速度、靜息狀態(tài)下血管管徑（D0）、充盈狀態(tài)下血管管徑（D1），并計(jì)算彈性程度（D1-D0）/D0。

1.2.4 創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量測(cè)定兩組患者于治療4周后采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量，石蠟包埋、切片、脫蠟、脫水、PBS洗涂（1 min×3次）、滴加VEGF/VEGF-R2/SRC（1:25）過夜，孵育，PBS清洗等操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。鏡下棕黃色和棕褐色顆粒即為陽性細(xì)胞。采用Image-Pro Plus 5.0進(jìn)行測(cè)量，分析圖中累計(jì)光密度值（IOD）。

1.2.5 創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達(dá)采用Real-time PCR檢測(cè)，于治療4周后提取兩組患者創(chuàng)面肉芽組織細(xì)胞總RNA、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行Real-time PCR監(jiān)測(cè)，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。引物序列VEGF: 上游5’-ATG AACTTTCTGCTGTCTTGGGT-3’，下游5’-AT CATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3’；VEGFR-2: 上游5’-TACACGCAGTTGCAGTACATCG-3’，下游5’-CGCAGGATCTGGTAGAGGAAGT-3’；Src：上游5’-GAGCGGCTCCAGATTGTAA-3’，下游5’-CTGGGGATGTAGCCTGTCTGT-3’；以GAPDH為內(nèi)參，引物序列：5’-CAATGACCCCT TCATTGACC-3’，5’-TGGAAGATGGTGATGG GATT-3’。反應(yīng)條件：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，40個(gè)PCR循環(huán)；繪制熔解曲線。以2-△△CT值法進(jìn)行相對(duì)定量分析，以目的基因初始模板相對(duì)量與GAPDH初始模板相對(duì)量的比值表示VEGF、VEGF-R2、SRC的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者創(chuàng)面愈合率比較與對(duì)照組相比，手術(shù)組治療后第2、4周時(shí)創(chuàng)面愈合率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 兩組患者治療前后下肢血管功能比較手術(shù)組與對(duì)照組患者治療前內(nèi)膜中層厚度、收縮期血管峰值血流速度、（D1-D0）/D0等指標(biāo)無明顯差異（P＞0.05）。治療后兩組患肢血管功能均較治療前明顯改善（P＜0.05），手術(shù)組較對(duì)照組療效更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2）。

表1 兩組患者創(chuàng)面愈合率比較

表2 兩組患者治療前后下肢血管功能比較（x±s）

2.3 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量比較治療4周后手術(shù)組創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量（IOD值）較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC含量比較

2.4 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達(dá)比較治療4周后手術(shù)組創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2），基因表達(dá)結(jié)果與免疫組化相一致。Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，SRC基因表達(dá)與VEGF-R2表達(dá)正相關(guān)（r=0.541，P＜0.05）。

圖2 兩組患者創(chuàng)面肉芽組織VEGF、VEGF-R2、SRC基因表達(dá)對(duì)比

3 討論

糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最隱匿，它影響著超過50%的糖尿病患者。糖尿病足在糖尿病患者中的發(fā)病率約為10%，糖尿病血管病變包括動(dòng)脈炎和小血管血栓形成；缺血引起的神經(jīng)病變和大血管動(dòng)脈粥樣硬化，三者疊加極易造成承重部位受累，引發(fā)糖尿病足潰瘍[10]。改善患足局部缺血對(duì)于促進(jìn)糖尿病足潰瘍恢復(fù)具有重要意義，經(jīng)皮腔內(nèi)球囊擴(kuò)張形成術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)是常用的改善下肢動(dòng)脈血運(yùn)的血管性介入治療手段。本研究發(fā)現(xiàn)，血管腔內(nèi)成形術(shù)治療較對(duì)照組患者創(chuàng)面愈合率明顯提高，下肢血運(yùn)功能明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明血管腔內(nèi)成形術(shù)對(duì)于促進(jìn)創(chuàng)面組織愈合，擴(kuò)張血管，改善局部血液循環(huán)有重要意義。

糖尿病足具有慢性創(chuàng)傷的所有特征，傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜，動(dòng)態(tài)和有序的控制過程，其中血管生成或新血管形成通過滋養(yǎng)新形成的組織來起到關(guān)鍵的病理生理學(xué)作用[11]。傷口愈合過程始于炎癥反應(yīng)，然后是新的組織和肉芽生成，募集和血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)。 PDGF，VEGF及其受體和TGF-β在這些過程中起關(guān)鍵作用，其中VEGF是血管生成的關(guān)鍵刺激因子，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和遷移，并且其受體具有酪氨酸激酶活性，直接調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞膜中的Ca2+通道開放[12]。有證據(jù)表明，糖尿病患者組織中VEGF的濃度降低，而VEGF在激活和指導(dǎo)傷口愈合的各個(gè)階段都是不可或缺的，具體而言，VEGF可誘導(dǎo)生產(chǎn)性細(xì)胞向受傷區(qū)域遷移；引導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，促進(jìn)起始血管的生成和成熟，刺激肉芽組織生長(zhǎng)；還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化和增殖，刺激傷口收縮[13]。本研究中發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)面肉芽組織VEGF含量在腔內(nèi)血管成形術(shù)后顯著提高，明顯高于對(duì)照組。說明血管腔內(nèi)成形術(shù)可以有效的恢復(fù)創(chuàng)面VEGF表達(dá)，改善傷口愈合的各階段的VEGF不足，這可能是術(shù)后創(chuàng)面愈合速率較快的機(jī)制之一。

VEGF通過結(jié)合跨膜受體（如VEGFR1和VEGFR2）發(fā)揮其生物學(xué)功能，兩者都在內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性表達(dá)，并含有胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。VEGF通過與其兩種受體酪氨酸激酶VEGF-R1和VEGF-R2在血管內(nèi)皮細(xì)胞上相結(jié)合，發(fā)揮調(diào)控血管生成的作用[14]。目前的研究表明，VEGF-R2似乎介導(dǎo)大多數(shù)已知的對(duì)VEGF-A的細(xì)胞應(yīng)答，在腫瘤血管生成過程中，VEGF介導(dǎo)的血管生成作用可能是SRC依賴的[15]。因此我們研究了血管腔內(nèi)成形術(shù)對(duì)SRC的影響，結(jié)果表明SRC在血管腔內(nèi)成形術(shù)后的表達(dá)亦明顯增加，而其對(duì)血管生成的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究，SRC的調(diào)控作用可能與MAPK信號(hào)通路有關(guān)，在SRC作用下Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路激活可能是術(shù)后肉芽組織愈合加快的重要原因[16]。另外，VEGF-R2與SRC的表達(dá)正相關(guān)，作為VEGF的下游信號(hào)分子，VEGF-R2與SRC在對(duì)血管腔內(nèi)成形術(shù)的療效評(píng)價(jià)方面可能有其獨(dú)特的意義，但具體相關(guān)性有待大樣本多中心數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴(kuò)張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)治療可有效的促進(jìn)糖尿病足患者創(chuàng)面愈合，改善患肢血運(yùn)功能。而其對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用可能是因?yàn)閯?chuàng)面肉芽組織VEGF/VEGF-R2/SRC軸的表達(dá)增加。術(shù)后VEGF及其下游VEGF-R2/SRC在創(chuàng)面肉芽組織乃至血清中的表達(dá)變化檢測(cè)，可能為糖尿病足患者經(jīng)皮血管腔內(nèi)球囊擴(kuò)張成形術(shù)聯(lián)合支架置入術(shù)的療效評(píng)估以及預(yù)后分析提供依據(jù)。