李新春，丁水印，王霞

目前心臟疾病嚴(yán)重威脅著中國居民的健康，心臟病患者存在不同程度心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，可導(dǎo)致患者慢性心力衰竭[1]，探討對心肌細(xì)胞的增殖和凋亡的調(diào)控可以為心臟的發(fā)病機(jī)制及治療從分子水平提供理論依據(jù)。Apelin作為G蛋白耦連受體的內(nèi)源性配體，在人體心、肺、肝等不同組織中均有不同程度表達(dá)[2]。左心室肥大的大鼠模型中，Apelin-13的表達(dá)顯著高于正常大鼠，且已證實，它與病理狀態(tài)下的心臟保護(hù)有關(guān)[3]。研究表明，Apelin-13通過ERK1/2信號通路誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞的增殖和自噬，同時可通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖[4]，但Apelin-13對心肌細(xì)胞增殖的影響未見報道。因此，本研究將通過Apelin-13及ERK1/2抑制劑-U0126的干預(yù)在細(xì)胞水平探討Apelin-13對H9c2心肌細(xì)胞增殖及ERK1/2信號通路活化的影響，進(jìn)一步闡釋Apelin-13對心肌細(xì)胞影響的機(jī)制，以期為心臟疾病的治療提供新的藥物治療靶點。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器H9C2心肌細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究院）；胎牛血清（FBS）、二甲亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基（碧云天生物技術(shù)研究所）；Apelin-13、U0126、MTT（美國圣克魯斯生物技術(shù)有限公司）；兔抗鼠p-ERK抗體、鼠單克隆抗體ERK、β-tubulin抗體（上海生物工程有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Hyclone-PIERCE生物技術(shù)有限公司）。

IX73倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）；聚丙烯酰胺垂直電泳（美國Bio-Tek生物儀器有限公司）；轉(zhuǎn)膜成像系統(tǒng)（美國Bio-Tek生物儀器有限公司）；Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國Bio-Tek生物儀器有限公司）；ELX-808酶標(biāo)儀（德國Eppendorf儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞使用含10% FBS、90% DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素（100 μg/ml）和青霉素（100 μg/ml）的細(xì)胞培養(yǎng)液，在含有5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)[5]。使用的培養(yǎng)液每2～3 d更換1次。待細(xì)胞生長到對數(shù)期時，接種到96孔培養(yǎng)板上，每孔4 ml（細(xì)胞數(shù)4×105/孔），最后進(jìn)行分組處理。

1.3 實驗分組和干預(yù)培養(yǎng)后的H9c2心肌細(xì)胞分為對照組、Apelin-13組、U0126組和Apelin-13+U0126四組，并分別用FBS、Apelin-13、U0126和 Apelin-13+U0126處理。Apelin-13溶解于磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2～7.3）中，U0126溶解于DMSO中。

對照組H9c2心肌細(xì)胞使用10%的FBS處理和DMSO處理；Apelin-13組H9c2心肌細(xì)胞分別使用濃度為0.0001，0.001，0.01和0.1 μmol/L的Apelin-13恒溫培養(yǎng)24 h；U0126干預(yù)組H9c2心肌細(xì)胞使用濃度為10 μmol/L的U0126恒溫培養(yǎng)24 h；Apelin-13+U0126組H9c2心肌細(xì)胞使用0.1 μmol/L的Apelin-13和10 μmol/L的U0126恒溫培養(yǎng)24 h。

1.4 MTT實驗采用MTT法測定H9c2心肌細(xì)胞的增值率[6]。將以上各實驗分組培養(yǎng)后的H9c2心肌細(xì)胞分別加入10 μl的MTT溶液（5 mg/ml）繼續(xù)恒溫培養(yǎng)4 h，然后棄去各組的培養(yǎng)液，使用PBS緩沖液洗滌2～3次后，各孔依次加入150 μl DMSO，隨后在37℃恒溫?fù)u床上緩慢震蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，最后使用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處測量各組各孔的光密度值（OD值，n=5）。細(xì)胞增殖率=OD實驗孔/ OD對照×100%。

1.5 Western blot實驗采用Western blot法測定各實驗組ERK1/2信號通路磷酸化水平[7]。將以上各實驗組處理的H9c2心肌細(xì)胞使用100 μl細(xì)胞裂解液（RIPA：PMSF=94:6）裂解，隨后在冰上孵育30 min，細(xì)胞裂解液在4℃低溫離心機(jī)中（r=18000 g）離心8 min，BCA蛋白試劑對離心后的上清蛋白定量，SDS-PAGE電泳對目的蛋白進(jìn)行分離并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維（PVDF）膜上。封閉液封閉1h后，使用鼠抗β-tubulin（1:250）、鼠抗ERK1/2（1:250）、兔抗p-ERK1/2（1:250）等一抗21℃孵育過夜，隨后PBS清洗后加入，分別加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:1000），室溫孵育4 h，超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯色液顯色，AlphaImager 2200凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描分析。ERK1/2和p-ERK1/2的相對表達(dá)量在β-tubulin灰度值基礎(chǔ)上進(jìn)行比較和半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素ANOVA檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Apelin-13促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞增殖在H9c2心肌細(xì)胞中，Apelin-13的干預(yù)顯著升高各濃度組心肌細(xì)胞的OD值，并隨Apelin-13濃度的增加OD值亦逐漸增加。與10%FBS的對照組比較，0.0001 μmol/L Apelin-13組的OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但0.001、0.01、0.1 μmol/L Apelin-13的干預(yù)增加了H9c2心肌細(xì)胞的OD值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中在0.001、0.01、0.1 μmol/L Apelin-13三組間的OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。從增值率的結(jié)果來看，各濃度組Apelin-13的干預(yù)明顯促進(jìn)了H9c2心肌細(xì)胞的增殖，并且在0.001～0.1 μmol/L Apelin-13之間，隨著濃度的增加H9c2心肌細(xì)胞的增殖率升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：Apelin-13顯著促進(jìn)了H9c2心肌細(xì)胞的增殖，并存在一定的濃度依賴性，見表1。

2.2 U0126抑制Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的增殖加入ERK1/2抑制劑U0126降低Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的OD值。DMSO組、U0126組、Apelin-13+U0126組與10%FBS組組間OD值無顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），且均低于0.1 μmol/L Apelin-13組（P＜0.05）；從增值率的結(jié)果來看，與0.1 μmol/L Apelin-13組比較，U0126的干預(yù)降低了H9c2心肌細(xì)胞的增值率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：ERK1/2抑制劑U0126顯著抑制了Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的增殖（表2）。

2.3 Apelin-13上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)在H9c2心肌細(xì)胞中，Apelin-13的干預(yù)升高各組心肌細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)量，并隨Apelin-13濃度的增加表達(dá)量亦逐漸增加。與10%FBS對照組比較，0.0001、0.001、0.01、0.1 μmol/L Apelin-13的干預(yù)上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)（P＜0.05），并且Apelin-13不同濃度四組間的p-ERK1/2的相對表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），圖1為p-ERK1/2及ERK1/2蛋白Western blot結(jié)果，圖2為相對定量結(jié)果。Apelin-13各濃度干預(yù)組H9c2心肌細(xì)胞ERK1/2的相對表達(dá)量較10%FBS對照組無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖3）。以上結(jié)果表明，Apelin-13顯著上調(diào)H9c2心肌細(xì)胞的p-ERK1/2表達(dá)量，并存在濃度依賴性，同時表明，ERK1/2信號通路調(diào)控Apelin-13誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

表1 Apelin-13各濃度對各實驗組OD值的影響（x ±s，n=5）

表2 U0126對Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞OD值的影響（x ±s，n=5）

圖1 各濃度Apelin-13干預(yù)組p-ERK1/2及ERK1/2蛋白的表達(dá)

圖2 Apelin-13各濃度對各實驗組p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

圖3 Apelin-13各濃度對各實驗組ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

圖4 U0126和Apelin-13干預(yù)組p-ERK1/2及ERK1/2蛋白的表達(dá)

2.4 U0126抑制Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的p-ERK1/2的表達(dá)ERK1/2抑制劑U0126降低Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的p-ERK1/2的表達(dá)。圖4為U0126加入后p-ERK1/2及ERK1/2蛋白Western blot結(jié)果，圖5為相對定量結(jié)果，在10%FBS組、DMSO組與U0126組間p-ERK1/2的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與10%FBS的對照組比較，Apelin-13組的p-ERK1/2的表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與Apelin-13組比較，Apelin-13+U0126組的p-ERK1/2的表達(dá)降低（P＜0.05），且U0126干預(yù)后p-ERK1/2的表達(dá)較10%FBS的對照組亦無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。如圖6所示，U0126加入后H9c2心肌細(xì)胞ERK1/2的相對表達(dá)量較10%FBS對照組無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，U0126抑制Apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的p-ERK1/2的表達(dá)，從而再次證明ERK1/2信號通路調(diào)控Apelin-13誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。

圖5 U0126對Apelin-13干預(yù)組 p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

心血管疾病一直困擾著中老年人的生活，嚴(yán)重危害人們的健康，其中多數(shù)心臟疾病主要原因為心肌缺血誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，從而造成心肌肥大受損，最終導(dǎo)致心力衰竭[8]。在系列研究中發(fā)現(xiàn)，極少的心肌細(xì)胞凋亡仍會對心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生極大的影響，在多種病理因素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞死亡的生理病理學(xué)過程不斷伴隨著心肌細(xì)胞的增殖和新生[9]。當(dāng)前，關(guān)于心肌細(xì)胞凋亡和增殖的分子機(jī)制仍在研究當(dāng)中，其中多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的的增殖和凋亡，其中涉及NF-kB、MAPK、PI3K等信號通路，從多種信號途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)其增殖將顯著改善心肌損傷[10]。因此，進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞的增殖凋亡機(jī)制將有助于探討心臟疾病的發(fā)病機(jī)制，并可能為臨床治療篩選出新的治療靶點。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是生物體內(nèi)一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，ERK是MAPK家族中傳遞絲裂原信號的關(guān)鍵激酶，可依賴于Ras/Raf/MEK/ERK通路的依次磷酸化而被激活，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖和分化[11]。ERK1/2 MAPK信號傳導(dǎo)通路是引起細(xì)胞增殖最為重要的信號傳導(dǎo)通路之一，現(xiàn)有研究表明，ERK1/2參與了慢性支氣管哮喘大鼠氣管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控，在平滑肌細(xì)胞中，ERK1/2 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著增高[12]；同時多種體外細(xì)胞實驗證實，ERK1/2 MAPK信號通路調(diào)控卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、表皮樣癌、非小細(xì)胞肺癌、惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤等腫瘤的增殖和凋亡[13]。

血管緊張素受（AT1-R）相關(guān)受體蛋白（APJ）為跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，其中Apelin為APJ的內(nèi)源性配體[14]。Apelin /APJ調(diào)節(jié)系統(tǒng)廣泛存在于人體內(nèi)各個系統(tǒng)并發(fā)揮著不同的生物學(xué)效應(yīng)，并且APJ與高血壓、心力衰竭、心肌肥大、缺血性心臟病、肺動脈高壓型心臟病等多種心血管疾病密切相關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，Apelin可對小鼠表皮生長因子tdgf-1基因進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而干擾小鼠胚胎干細(xì)胞向心臟的增殖發(fā)育[16]。

圖6 U0126對Apelin-13干預(yù)組ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

Apelin-13為APJ 的內(nèi)源性激動劑，它在提高細(xì)胞酸化率、抑制cAMP生成和促進(jìn)細(xì)胞趨化等方面有較強(qiáng)的生物活性，研究證明，Apelin-13可以通過增強(qiáng) APJ 的作用，提高人胚胎干細(xì)胞（hESCs）向心肌細(xì)胞的定向分化效率[17]，同時Apelin-13可通過PKC-ERK1/2 -Cyclins通路促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖[18]。相關(guān)實驗證明Apelin-13還可以促進(jìn)多種癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，Apelin-13可通過激活ERK1/2從而作用于相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等多種底物進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞細(xì)胞核，調(diào)控cyclinD1等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而參與癌細(xì)胞的生長、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生理過程[19]。

Apelin-13對多種因素引起的急慢性心肌損害均具有明顯的保護(hù)作用。與急性心肌缺血模型組相比，Apelin-13的干預(yù)顯著提高了大鼠的心肌收縮力，降低左心室舒張期末壓和改善多種心臟功能指標(biāo)[20]。左心室肥大的大鼠模型中，Apelin-13的表達(dá)顯著高于正常大鼠，且已證實，這與病理狀態(tài)下的心臟保護(hù)有顯著的相關(guān)性[21]，但具體機(jī)制仍未明確。本研究證明Apelin-13在細(xì)胞水平顯著促進(jìn)了H9c2心肌細(xì)胞的增殖，并存在顯著的濃度依賴性，此研究結(jié)果與上述動物體內(nèi)實驗結(jié)果相一致，同時表明，Apelin-13通過促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖而顯著改善了大鼠的心功能；同時本研究表明，Apelin-13顯著上調(diào)了H9c2心肌細(xì)胞p-ERK1/2的表達(dá)，并與Apelin-13的濃度顯著相關(guān)，并且ERK1/2抑制劑U0126明顯抑制了H9c2心肌細(xì)胞的增殖，并下調(diào)了p-ERK1/2的表達(dá)。

綜上所述，以上結(jié)果表明ERK1/2信號通路調(diào)控Apelin-13誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，這一結(jié)果首次闡明Apelin-13促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，并可為心臟疾病的治療及預(yù)防提供了新的研究方向。在臨床中，心肌細(xì)胞的凋亡廣泛存在于多種心肌病以及心功能衰竭的患者中，因此Apelin-13將可能成為治療與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)疾病的重要手段。