郭素真， 馬丙祥， 李瑞星， 李華偉， 陳恬恬， 張晰， 葉玉香

腦性癱瘓(簡稱腦癱)是一組持續(xù)存在的中樞性運(yùn)動(dòng)和姿勢發(fā)育障礙、活動(dòng)受限證候群，這種證候群是由于發(fā)育中的胎兒或嬰幼兒腦部非進(jìn)行性損傷所致。多伴有感覺、知覺、認(rèn)知、交流和行為障礙及癲癇、繼發(fā)性肌肉骨骼問題[1]。腦癱的病因多與圍生期窒息、早產(chǎn)、出生低體質(zhì)量、感染、病理性黃疸、顱內(nèi)出血、先兆流產(chǎn)、多胎等因素有關(guān)[2]。其中，早產(chǎn)和宮內(nèi)感染是腦癱發(fā)生的重要因素之一。有研究顯示，在低、中等收入國家早產(chǎn)兒的發(fā)生率可達(dá)15%以上[3-4]，我國的早產(chǎn)兒出生率約為8.1%[5]。李曉捷等[6]研究發(fā)現(xiàn)通過對孕鼠腹腔注射脂多糖，可造成早產(chǎn)腦損傷模型仔鼠，從而為研究宮內(nèi)感染造成腦損傷的機(jī)制提供了途徑和方法。目前對小兒腦癱的治療，我國主要采用中醫(yī)傳統(tǒng)的康復(fù)方法和現(xiàn)代的康復(fù)技術(shù)相結(jié)合的方法。針灸作為傳統(tǒng)特色療法在其中發(fā)揮了重要的作用。本研究通過觀察不同時(shí)間點(diǎn)及療程俞募穴速刺對宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)腦損傷大鼠腦組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)表達(dá)的影響，探討俞募穴速刺對神經(jīng)元的保護(hù)作用及療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)成熟雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量(300±50)g；SPF級(jí)成熟雌性SD大鼠30只，體質(zhì)量(250±50)g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購入，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(豫)2015-0004。

1.2 主要試劑與儀器 脂多糖(Sigma)；TNF-α抗體(博士德)；IL-6抗體(博奧森)；針灸針(天協(xié)牌，0.30 mm×30 mm)。自動(dòng)包埋機(jī)EG1150；石蠟切片機(jī)RM2245；攤片機(jī)HII220；烘片機(jī)HII220；BH-2光學(xué)顯微鏡；徠卡倒置顯微鏡DMIL；圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus)。

1.3 造模與分組 參照李曉捷等[6]研究方法建立宮內(nèi)感染/炎癥致早產(chǎn)仔鼠腦室旁白質(zhì)軟化模型。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，于17:00按雌雄比2∶1將大鼠進(jìn)行合籠。次日上午8時(shí)取雌鼠陰道脫落細(xì)胞于光學(xué)顯微鏡下觀察，以鏡下觀察到大量絲狀精子和落葉狀角質(zhì)細(xì)胞記為孕第0天。共檢出懷孕大鼠20只，按隨機(jī)數(shù)字表法選取6只孕鼠為生理鹽水組，其余14只孕鼠為脂多糖組。在孕鼠孕期的第16、17天連續(xù)2 d行腹腔注射，脂多糖組按照350 μg/(kg·d)注射脂多糖，生理鹽水組注射等量生理鹽水，仔鼠出生后記錄孕鼠分娩時(shí)間及仔鼠體質(zhì)量，以胎齡≤21 d的仔鼠記為早產(chǎn)仔鼠。分娩當(dāng)天取脂多糖組及生理鹽水組仔鼠各6只行腦組織病理學(xué)檢測。確定造模成功后，取早產(chǎn)仔鼠40只按隨機(jī)數(shù)字表法分為早短期針刺組(n=10)、晚短期針刺組(n=10)、長期針刺組(n=10)、模型對照組(n=10)；取正常足月仔鼠為空白對照組(n=10)。

1.4 分組干預(yù) 所有仔鼠同等條件喂養(yǎng)，空白對照組及模型對照組每日按針刺組方法固定1次，不針刺。各針刺組取俞募穴，以速刺手法進(jìn)行干預(yù)，每日1次，早短期針刺組從生后第1天開始干預(yù)，連續(xù)針刺7 d；晚短期針刺組從生后第15天開始干預(yù)，連續(xù)針刺7 d；長期針刺組從生后第1天開始干預(yù)，連續(xù)針刺21 d；模型對照組和空白對照組不給予針刺干預(yù)，各組大鼠均于21日齡取材檢測腦組織IL-6和TNF-α。

俞募穴速刺方法：參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》定位[7]，選穴：心俞、脾俞、腎俞、關(guān)元、中脘和中極。根據(jù)穴位針刺的方向和深度要求采用快速進(jìn)針、快速出針、不留針的針刺方法。其中心俞、脾俞、腎俞直刺6 mm不留針。關(guān)元、中脘、中極直刺2 mm不留針。

1.5 標(biāo)本制備及實(shí)驗(yàn)室檢查

1.5.1 標(biāo)本制備 仔鼠出生即刻，選脂多糖組和生理鹽水組孕鼠各2只，取子宮及胎盤放置于10%中性甲醛中固定；選脂多糖組早產(chǎn)鼠和生理鹽水組足月產(chǎn)仔鼠各6只，在冰盒上斷頭取腦組織，冷生理鹽水沖洗數(shù)次后，取腦組織于耳間線前2 mm水平處行冠狀切片，取組織厚度約3 mm，10%中性甲醛固定。仔鼠于21日齡腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，取材及處理方法同上。

1.5.2 病理學(xué)檢測 取固定好的子宮、胎盤及生后即刻處死的仔鼠腦組織，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，切片厚度3 μm，60 ℃溫箱過夜烤片。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察子宮、胎盤情況及腦室旁白質(zhì)損傷情況。

1.5.3 免疫組織化學(xué)檢測 取21日齡仔鼠腦組織，進(jìn)行脫水、透明、梯度浸蠟、包埋、切片、烤片。取組織切片進(jìn)行脫蠟、水化、3%H2O2室溫孵育10 min；5%BSA封閉液室溫封閉20 min；孵IL-6一抗或TNF-α一抗(1∶100)，37 ℃恒溫60 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；孵二抗37 ℃恒溫箱孵育40 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃恒溫孵育30 min；磷酸鹽緩沖液4 min×3次；DAB室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染2 min，自來水進(jìn)行沖洗；脫水，透明，中性樹脂封固后，高倍顯微鏡下觀察腦組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)，以細(xì)胞漿有棕黃色顆粒沉著為陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域采用美國Image-Pro Plus軟件進(jìn)行光密度值測定，取平均光密度值(mean optical density value，MOD)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 14只脂多糖組孕鼠中，1只在注射脂多糖次日陰道出血，娩出死亡胎鼠，3只在注射脂多糖后死亡，1只足月分娩，予以剔除，其余9只脂多糖組雌鼠均于孕22 d前分娩。共產(chǎn)出77只早產(chǎn)仔鼠，其中死產(chǎn)仔鼠25只。對照組6只雌鼠全部足月分娩，共產(chǎn)出60只足月產(chǎn)仔鼠，無死產(chǎn)仔鼠。

2.2 新生仔鼠情況 脂多糖組所產(chǎn)仔鼠與對照組出生體質(zhì)量低，活產(chǎn)仔鼠少。脂多糖組仔鼠出生時(shí)皮膚顏色暗紅或紫紺，活動(dòng)少。對照組仔鼠出生時(shí)體質(zhì)量比脂多糖組高、活動(dòng)比脂多糖組頻繁、應(yīng)激反應(yīng)比脂多糖組快，皮膚紅潤。

2.3 病理學(xué)觀察 子宮及胎盤HE染色示：生理鹽水組孕鼠子宮及胎盤組織未見明顯炎癥反應(yīng)，未見大量中性粒細(xì)胞浸潤。脂多糖組孕鼠子宮壁及胎盤可見大量的中性粒細(xì)胞浸潤，血管充血。

新生仔鼠腦組織病理結(jié)果：對照組仔鼠腦組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列均勻整齊，胞核較大。脂多糖組仔鼠腦室旁白質(zhì)結(jié)構(gòu)稀疏，細(xì)胞水腫，神經(jīng)纖維排列不齊，神經(jīng)元數(shù)目少，可見角質(zhì)細(xì)胞聚集，側(cè)腦室出血改變。

2.4 各組仔鼠腦組織免疫組織化學(xué)指標(biāo)比較 見表1。

表1 各組仔鼠腦組織免疫組織化學(xué)指標(biāo)比較

表1結(jié)果表明，各針刺組下調(diào)腦組織中IL-6和TNF-α的表達(dá)，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；長期針刺組IL-6和TNF-α表達(dá)的下調(diào)優(yōu)于短期針刺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；早短期針刺組IL-6和TNF-α表達(dá)的下調(diào)優(yōu)于晚短期針刺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)感染/炎癥是導(dǎo)致腦癱發(fā)生的高危險(xiǎn)因素[8]，宮內(nèi)感染常伴有腦缺氧缺血，在此過程中促炎癥細(xì)胞因子可以造成急性腦白質(zhì)損傷，而因此導(dǎo)致的腦室旁白質(zhì)軟化。腦室旁白質(zhì)軟化是早產(chǎn)兒中最具代表性的腦白質(zhì)損傷，而炎癥反應(yīng)在早產(chǎn)兒腦室旁白質(zhì)軟化的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用[9]。IL-6、TNF-α是導(dǎo)致腦室旁白質(zhì)軟化發(fā)生的兩個(gè)最常見炎性細(xì)胞因子，這些炎性細(xì)胞因子通過損傷未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞或者間接的小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起的白質(zhì)損傷，從而直接影響胎兒大腦發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[10]。宮內(nèi)感染時(shí)IL-6、TNF-α等炎性因子的升高，與胎兒腦白質(zhì)損害呈正相關(guān)[11]。何柳芳等[12]認(rèn)為在炎性反應(yīng)導(dǎo)致腦室旁白質(zhì)軟化發(fā)生的過程中，TNF-α是最早釋放的促炎癥因子，參與了腦損傷炎性反應(yīng)的整個(gè)過程，且研究表明TNF-α增加較IL-1β更早一些。它可刺激小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，增加其他細(xì)胞因子的表達(dá)及促使活性氧、活性氮的增加，致使少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷的發(fā)生。早期干預(yù)可減輕腦損傷高危兒的神經(jīng)損傷，降低腦癱的發(fā)生率，故對于腦損傷患兒要早診斷、早干預(yù)。

馬丙祥等提出“痰”和“瘀”是腦損傷的主要病理因素，進(jìn)行了相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為一氧化氮合酶、血小板活化因子、TNF-α、IL-6等可能是腦損傷“痰”“瘀”的本質(zhì)[13-15]。因腦癱患兒多有早產(chǎn)、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、宮內(nèi)感染等胎兒期疾病史，考慮其存在先天稟賦不足，先天之精不能充養(yǎng)腦髓及五臟六腑、四肢百骸，經(jīng)脈氣血運(yùn)行無力，正氣不足，故易被胎內(nèi)邪氣所侵染，由虛致瘀，痰飲、瘀血生之。而“痰飲、瘀血”等病理產(chǎn)物的留存，損傷腦髓、臟腑的同時(shí)，更加重了經(jīng)絡(luò)阻滯不通，不能正常輸布先天、后天之精氣，使患兒日益虛損，形成了惡性循環(huán)?；诖?，我們提出了“臟腑失調(diào)，腦髓失養(yǎng)”是腦癱發(fā)生的重要中醫(yī)病理機(jī)制。如何能在改善腦癱患兒臨床癥狀的同時(shí)，提高患兒體質(zhì)，使對腦癱患兒的治療能夠步入日益好轉(zhuǎn)的良性循環(huán)，是目前臨床亟需解決的問題。在此，我們嘗試運(yùn)用“調(diào)節(jié)臟腑，充養(yǎng)腦髓”之法，取俞募配穴進(jìn)行針刺治療腦癱患兒，以期能夠在一定程度上解決上述問題。

腦癱中醫(yī)病位在腦，但與心、肝、脾、腎等臟腑都有密切的聯(lián)系，俞募穴主要分布于任脈、胃經(jīng)、肝經(jīng)、膀胱經(jīng)。因此，從中醫(yī)學(xué)理論上來說針刺俞募穴具有治療腦部疾患的作用。心主神明，《素問·靈蘭秘典論》謂：“心者，君主之官也，神明出焉”，《本草綱目·辛夷·發(fā)明》載“腦為元神之府”，腎主骨生髓，髓通于腦，“諸髓者，皆屬于腦”，“腦為心之使”，“腎氣上通與腦”，可見腦與心腎關(guān)系密切。針刺心腎俞募穴可補(bǔ)腎生髓，開心竅，醒神智，促進(jìn)腦的發(fā)育，提高患兒智力。心開竅于舌，針刺心臟俞募穴不僅可以提高患兒智力，亦可以促進(jìn)其語言功能的發(fā)育，心與小腸相表里，針刺小腸募穴關(guān)元具有同樣的治療效果。腎開竅于耳，針刺腎臟的俞募穴可以改善患兒追聽差、反應(yīng)不靈敏的情況，腎與膀胱相表里，針刺膀胱經(jīng)募穴中極亦可起到相應(yīng)的治療效果。故俞募配穴針刺療法具有應(yīng)用于腦病治療的理論基礎(chǔ)[16]。通過相關(guān)臨床研究發(fā)現(xiàn)，俞募穴速刺法在促進(jìn)腦癱患兒腦發(fā)育粗大運(yùn)動(dòng)功能、體格生長、減少感染次數(shù)和提高智力水平等方面均取得顯著療效[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明應(yīng)用俞募穴速刺法可下調(diào)宮內(nèi)感染/炎癥所致早產(chǎn)腦損傷大鼠IL-6和TNF-α的表達(dá)，提示俞募穴速刺治療腦損傷的機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)腦組織炎性因子水平，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，從而避免或減輕腦室旁白質(zhì)軟化的進(jìn)展。且研究發(fā)現(xiàn)腦損傷早期應(yīng)用俞募穴速刺對于炎性因子的調(diào)節(jié)作用優(yōu)于晚期應(yīng)用，長療程應(yīng)用效果優(yōu)于短期應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)為俞募穴速刺法的進(jìn)一步臨床推廣應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對于治療宮內(nèi)感染/炎癥所致的早產(chǎn)腦損傷并改善預(yù)后具有重要的意義，提倡早期、長療程應(yīng)用。在臨床的治療中，俞募穴速刺法充分體現(xiàn)了中醫(yī)治療的特色與優(yōu)勢，其不僅可以促進(jìn)腦損傷患兒的康復(fù)，且痛苦小，更容易被患兒及家長接受，值得我們在臨床推廣應(yīng)用。