彭祖茂， 朱 麗， 鄧夢(mèng)雅， 張協(xié)光， 鄭裕輝

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，國家營養(yǎng)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣東)，廣東深圳518109)

食用植物油是人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵分?。在我國主要食用植物油有大豆油、菜籽油、花生油、玉米油、芝麻油、橄欖油、山茶油和亞麻籽油等。隨著人們對(duì)營養(yǎng)膳食需求的提高，食用植物油的營養(yǎng)功能也備受關(guān)注［1－3］。但是，人們對(duì)植物油中營養(yǎng)成分的了解更多停留在脂肪酸的組成上，對(duì)植物油中其他微量的營養(yǎng)成分知之甚少。市面上不同植物油的辨別也主要根據(jù)脂肪酸組成來區(qū)分［4］。除脂肪酸外，植物油中還存在維生素E、植物甾醇、角鯊烯、類胡蘿卜素等營養(yǎng)成分［5－7］。然而，向植物油中摻入其他少量廉價(jià)植物油也會(huì)存在脂肪酸組成合格的情況。因此，僅僅依靠脂肪酸組成來判斷植物油是否為純正植物油存在一定漏洞，給不法商家提供了摻假、摻偽的可乘之機(jī)。

維生素 E 包括生育酚(α-生育酚(α-T)、β-生育酚(β-T)、γ-生育酚(γ-T)、δ-生育酚(δ-T))和生育三烯酚(α-生育三烯酚(α-T3)、β-生育三烯酚(β-T3)、γ-生育三烯酚 (γ-T3) 和 δ-生育三烯酚(δ-T3))。維生素E的主要檢測(cè)方法有反相液相色譜法和正相液相色譜法［8，9］。反相液相色譜法主要采用C30色譜柱或五氟苯基(PFP)色譜柱，以甲醇-水為流動(dòng)相;而正相色譜法則采用硅膠柱，以正己烷等為流動(dòng)相，但是穩(wěn)定性較反相色譜法差，色譜柱使用壽命短。此外，氣相色譜法［10－12］也被用于食品中維生素E的檢測(cè)。

植物甾醇是一類以環(huán)戊烷多氫菲為骨架的物質(zhì)［13］，植物油中主要含有菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇，主要分離手段有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法和高速逆流色譜法，同時(shí)結(jié)合紫外檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)手段，以實(shí)現(xiàn)不同甾醇的定性和定量分析［14－16］。

β-胡蘿卜素是一種類胡蘿卜素，在450 nm處有較強(qiáng)吸收，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法和超高效液相色譜-質(zhì)譜法是 β-胡蘿卜素的主要檢測(cè)方法［17，18］。高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)，有機(jī)溶劑消耗大;超高效液相色譜-質(zhì)譜法分析時(shí)間快，溶劑消耗少。

角鯊烯是一種全反式三萜烯化合物［19］，主要采用氣相色譜法-氫火焰檢測(cè)器法、氣相色譜法-質(zhì)譜法或高效液相色譜法檢測(cè)，其中以氣相色譜法分析最為普遍［20－22］。

維生素E、β-胡蘿卜素、植物甾醇和角鯊烯均屬于不皂化物，可以建立一種快速、同步分析植物油中不同營養(yǎng)成分的高通量檢測(cè)方法［23－26］。但受色譜柱或檢測(cè)器的限制，已有分析的方法主要集中分析維生素E中的α-T，植物甾醇中的谷甾醇和豆甾醇。目前尚未有同時(shí)分析8種維生素E、4種植物甾醇、β-胡蘿卜素和角鯊烯的報(bào)道。本課題擬采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-MS/MS)技術(shù)，建立同步檢測(cè)植物油中8種維生素E、4種植物甾醇、β-胡蘿卜素和角鯊烯共14營養(yǎng)成分含量的方法，旨在為食用植物油的溯源技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)，為相關(guān)企業(yè)，監(jiān)督機(jī)構(gòu)以及消費(fèi)者提供技術(shù)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器、試劑與材料

Ultimate 3000超高效液相色譜儀、TSQ Quautis三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司);Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heido1ph公司);Sartorius萬分之一電子天平(北京賽多利斯公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:α-T、β-T、γ-T、δ-T(純度≥98%，美國Supelco 公司); α-T3、β-T3、γ-T3和 δ-T3(純度≥98%)、β-胡蘿卜素(純度≥97%)、角鯊烯(純度≥99.0%)(美國Sigma-Aldrich公司);菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇(純度≥98%，上海Anpel公司)。14種標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)式見圖1，用甲醇配制14種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－18℃下保存。

甲醇、甲酸(色譜純，德國Merck公司);無水乙醇(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);氫氧化鉀、無水硫酸鈉、抗壞血酸和石油醚(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)。

1．2 樣品前處理

稱取植物油樣品0.1 g(精確至0.000 1 g)，置于錐形瓶中，加入2 g抗壞血酸、10 mL水，渦旋振蕩搖勻，然后加入30 mL無水乙醇和15 mL 50%(v/v)氫氧化鉀水溶液，搖勻，于70℃皂化1 h;冷卻后，用40 mL石油醚萃取3次，合并提取液，用水洗滌至中性，將石油醚層轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，旋至近干，氮?dú)獯蹈珊?，用甲醇定容，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，待分析。

1．3 色譜條件

色譜柱:Poroshell 120 PFP柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm);柱溫:30℃;流動(dòng)相:A 為 0.1%(v/v)甲酸水溶液，B為0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min，85%B～95%B;1.0～7.0 min，95%B;7.0～12.5 min，95%B～100%B;12.5～ 13.0 min，100%B～85%B。進(jìn)樣量:5 μL。

圖1 14種營養(yǎng)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig．1 Chemical structures of the 14 nutrients

1．4 質(zhì)譜條件

離子源:大氣壓化學(xué)電離(APCI)源;離子模式:正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式;離子源溫度:300℃;離子傳輸管溫度:300℃;充電電流:6 μA;鞘氣(N2)流速:9 L/min;輔助氣(N2)流速:1.5 L/min;吹掃氣流速:0.6 L/min。14種營養(yǎng)成分的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 14種營養(yǎng)成分的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 14 nutrients

2 結(jié)果與討論

2．1 離子源的選擇

實(shí)驗(yàn)考察了電噴霧電離(ESI)源和APCI源對(duì)14種營養(yǎng)成分的離子化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用ESI源時(shí)，部分維生素E和β-胡蘿卜素的離子化效率較低。采用APCI源時(shí)，維生素E和β-胡蘿卜素、植物甾醇以及角鯊烯均能達(dá)到較高的離子化程度，其中植物甾醇中［M+H－H2O］+碎片離子的響應(yīng)最高;角鯊烯的子離子中m/z為149的碎片離子響應(yīng)強(qiáng)度高于m/z為231的碎片離子。但是，以m/z 149為定量離子時(shí)，β-T3、γ-T3也會(huì)有響應(yīng)，為減少干擾，選擇m/z 231為定量離子。

2．2 色譜柱的選擇

前期研究［27］發(fā)現(xiàn)，Poroshell 120 PFP 色譜柱在反相液相色譜系統(tǒng)下，不僅能實(shí)現(xiàn)β-T、γ-T和β-T3、γ-T3的分離，還能同時(shí)完成 β-胡蘿卜素和磷酯類物質(zhì)的基線分離。同時(shí)發(fā)現(xiàn)菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和 β-谷甾醇以及角鯊烯在 Poroshell 120 PFP色譜柱上也有很好的分離效果，且峰形尖銳，分析時(shí)間快，在12 min內(nèi)便可完成所有物質(zhì)的檢測(cè)(見圖2)。因此實(shí)驗(yàn)選擇Poroshell 120 PFP為分析色譜柱。

圖2 14種營養(yǎng)成分的提取離子色譜圖Fig．2 Extracted ion chromatograms of the 14 nutrients

2．3 基質(zhì)效應(yīng)(ME)

基質(zhì)效應(yīng)是指目標(biāo)物以外的其他組分對(duì)目標(biāo)物測(cè)定值的影響，包括基質(zhì)抑制效應(yīng)和基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，用離子基質(zhì)抑制率或增強(qiáng)率(L)表示。L=(基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率－溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100%，當(dāng)L＞0，表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)L＜0，表示基質(zhì)抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)考察了14種營養(yǎng)成分在實(shí)際樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，得到基質(zhì)效應(yīng)分布結(jié)果(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)際樣品中基質(zhì)對(duì)5種營養(yǎng)成分(β-胡蘿卜素、α-T3、α-T、菜油甾醇和豆甾醇)有抑制效應(yīng)，可能是內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)APCI源離子化過程中的電離抑制效果導(dǎo)致;其余9種營養(yǎng)成分均有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

圖3 14種營養(yǎng)成分的離子抑制或增強(qiáng)率Fig．3 Ion suppression or enhancement percentages of the 14 nutrients

2．4 線性范圍、檢出限和定量限

分別取14種營養(yǎng)成分的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制質(zhì)量濃度為0.05～10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以營養(yǎng)成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。結(jié)果表明，14種營養(yǎng)成分在0.05～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.997 1。檢出限和定量限分別以3倍信噪比(S/N)和10倍S/N計(jì)，結(jié)果表明，檢出限為0.01～0.30 μg/g，定量限為0.04～1.00 μg/g。

2．5 回收率與精密度

選取混合植物油為樣品，分別加入0.05、1.00和5.00 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察低、中、高不同添加水平下14種營養(yǎng)成分的回收率(見表3)。結(jié)果表明，14種營養(yǎng)成分的加標(biāo)回收率為80.7%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均＜6.0%。

表2 14種營養(yǎng)成分的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients(r)，LODs and LOQs of the 14 nutrients

表3 14種營養(yǎng)成分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the 14 nutrients(n=6)

2．6 穩(wěn)定性

選取混合植物油為樣品，按1.2節(jié)描述處理，然后將混合植物油提取液分別保存 0、4、8、12、24、48和72 h，然后檢測(cè)14種營養(yǎng)物質(zhì)的峰面積(見圖4)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在72 h內(nèi)，14種營養(yǎng)成分的穩(wěn)定性好，其峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于9.7%。

圖4 提取液存放時(shí)間對(duì)14種營養(yǎng)成分峰面積的影響(n=6)Fig．4 Effect of different storage time on the peak areas of the 14 nutrients(n=6)

2．7 實(shí)際樣品測(cè)定

本方法選取常見的11種植物油進(jìn)行分析(見表4)。結(jié)果表明，11種植物油中除活性最高的α-T外，還存在其他形式的生育酚和生育三烯酚。在菜籽油和橄欖油中檢出β-胡蘿卜素，含量分別為(4.7±0.6)mg/kg 和(4.4±0.2)mg/kg。植物油中還含有大量的植物甾醇，在菜籽油、玉米油中含量最高，在山茶油中含量最低;其中，大豆油中豆甾醇含量是所有植物油中含量最高的，而在菜籽油、橄欖油和核桃油中均未檢出豆甾醇，因此，豆甾醇可以作為大豆油的特征營養(yǎng)指標(biāo)。角鯊烯在橄欖油中的含量最高，芝麻油中最低。因此，角鯊烯可以作為橄欖油的特征營養(yǎng)指標(biāo)。

表4 實(shí)際植物油樣品中14種營養(yǎng)成分的含量(，n=3)Table 4 Contents of the 14 nutrients in real plant oil samples(，n=3)mg/kg

表4 實(shí)際植物油樣品中14種營養(yǎng)成分的含量(，n=3)Table 4 Contents of the 14 nutrients in real plant oil samples(，n=3)mg/kg

ND:not detected．

Compound Rapeseed oil oil peanut oil oil oil oil oil oil oil esame oil Walnut oil Peanut Black Corn Soybean Olive Camellia Linseed Cannabis S α-T 124．0±6．2 159．7±4．8 146．3±5．5 157．5±8．2 103．7±2．3 149．6±6．7 94．6±4．5 16．1±0．5 49．8±1．7 22．0±0．2 12．9±0．59 γ-T 376．8±17．9 145．7±3．8 123．1±1．1 442．4±15．5 504．8±21．0 17．8±0．4 14．5±0．2 153．4±1．6 385．4±4．8 313．4±13．4 81．4±3．9 β-T ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND δ-T 26．4±0．7 27．3±0．5 22．7±0．7 33．1±1．5 118．0±4．0 13．2±0．6 15．6±0．3 14．0±0．6 26．7±0．9 25．5±0．4 25．9±1．1 α-T3 2．3±0．04 2．7±0．05 3．1±0．2 12．5±0．3 2．9±0．05 3．3±0．1 2．9±0．04 3．0±0．1 3．0±0．1 2．8±0．05 3．1±0．05 γ-T3 7．4±0．04 8．2±0．04 8．4±0．6 11．9±0．4 8．8±0．1 2．8±0．04 2．6±0．05 2．7±0．1 3．2±0．2 9．2±0．2 3．0±0．06 β-T3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND δ-T3 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND β-Carotene 4．7±0．6 ND ND ND ND 4．4±0．2 ND ND ND ND ND Brassicasterol 1138±36．6 11．1±1．1 17．6±2．2 71．8±4．4 24．6±0．2 1．2±0．07 4．5±0．4 65．3±1．7 20．9±1．9 45．0±2．1 18．9±0．9 Campesterol 2158±94．3 301．9±13．4 379．5±8．8 1421±87．5 535．2±28．8 48．8±2．2 30．8±1．5 619．8±17．0 565．7±20．0 770．3±23．8 77．2±0．6 Stigmasterol ND 233．4±17．4 250．3±14．5 473．4±19．0 511．8±9．0 ND 31．6±2．0 210．2±9．4 79．4±3．4 375．4±13．7 ND β-Sitosterol 3226±80．6 1369±64．7 1573±34．9 4288±74．6 1339±33．8 1014±23．0 55．2±1．5 1173±10．2 2450±38．4 2648±79．0 1059±34．3 Squalene 42．2±1．7 147．4±4．3 140．8±4．3 111．7±4．0 46．0±1．2 4310±11．9 87．7±3．1 24．6±0．9 86．7±1．6 20．1±0．9 28．2±0．8

3 結(jié)論

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同步檢測(cè)植物油中14種營養(yǎng)成分的高通量方法。該法線性范圍廣，分析時(shí)間快，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于植物油的樣品分析，可進(jìn)一步用于植物油質(zhì)量控制的研究。