何培新， 吳雙雙， 鄭 凱， 許春平*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司許昌卷煙廠，河南許昌461000）

楊樹桑黃，即瓦尼木層孔菌 （Phellinus vaninii Ljub），是一種生長在楊樹上的藥用真菌，俗稱為楊黃，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木（針）層孔菌屬（Phellinus）[1]，是近年來被廣泛關(guān)注的桑黃“新秀”。桑黃是國際公認(rèn)的生物治癌領(lǐng)域中效率最高的大型真菌[2]，有報道楊黃具有與傳統(tǒng)桑黃同樣的抑制腫瘤的功效[3-4]，我國傳統(tǒng)中藥中用于治療痢疾、盜汗、血崩等[5]。近幾年，對瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經(jīng)獲得成功[6-8]，但是關(guān)于瓦尼木層孔菌活性物質(zhì)多糖結(jié)構(gòu)和生物活性相關(guān)的報道很少。

作者對發(fā)酵罐制得的楊樹桑黃EPS進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)表征和抗氧化的測定，為進(jìn)一步研究楊樹桑黃EPS的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌珠楊樹桑黃來源于鄭州輕工業(yè)學(xué)院發(fā)酵工程研究室，于斜面培養(yǎng)基上4℃保存。

1.1.2 發(fā)酵罐種子液的制備用打孔器取平板邊緣新生菌絲兩塊，接種到含有50 mL種子液的250 mL錐形瓶中，于160 r/min、26℃的搖床中培養(yǎng)4 d。然后向種子液中加入適量滅菌磁珠和玻璃珠，用磁力攪拌器將菌絲球打碎后備用。本研究所有接種體積分?jǐn)?shù)均為4%。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件采用搖瓶優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基：40 g/L 蔗糖，4 g/L 玉米粉，4 mmol/L KH2PO4，pH 7，發(fā)酵培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度160 r/min，進(jìn)氣量2 vvm。

1.1.4 透析袋采用截留相對分子質(zhì)量3 500，直徑22 mm，壓平寬度34 mm（上海索萊寶生物科技有限公司）的透析袋。

1.1.5 主要儀器SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；5L攪拌式發(fā)酵罐：上海百倫科技有限公司；CXG-1恒溫層析柜（含DLH-A恒流泵，DBS-100全自動收集器）：上海青浦滬西儀器公司；UV-17001C紫外分光光度計(jì)：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；Sepharose CL-6B層析柱：上海索萊寶生物技術(shù)公司；日本EYELA全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-2100：東京理化器械株式會社；Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀：美國尼高力儀器公司；尺寸排阻色譜-多角度激光光散射（SEC-MALLS）：美國懷亞特技術(shù)公司。

1.1.6 主要化學(xué)試劑蔗糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、無水乙醇、KH2PO4、NaNO3、NaN3、KBr、吡啶、甲醇：均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；玉米粉：購自蓮花市場；藍(lán)色葡聚糖2000、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）：購自上海玉博生物科技有限公司；Sepharose CL-6B：購自Solarbio公司；三氟乙酸（色譜純）：購自阿拉??；三甲基氯硅烷（BSTFA∶TMCS，99∶1）（色譜純）：東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液中多糖的提取利用抽濾法[9]分離菌絲體和發(fā)酵液，將所得發(fā)酵液旋蒸濃縮至100 mL左右，加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜，然后10 000 r/min離心15 min，得到多糖沉淀。

1.2.2 sevag法脫蛋白用適量蒸餾水使所得多糖沉淀完全溶解，加入約1/3多糖溶液的脫蛋白液（V氯仿∶V正丁醇=5∶1），置于磁力攪拌器上 30 min，然后于分液漏斗中靜置20 min，除去下層的有機(jī)相，保留水相，重復(fù)操作4～5次，直至有機(jī)相與水相間無明顯沉淀為止。將所有水相濃縮至100 mL左右，加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜，然后10 000 r/min離心15 min，得到粗多糖沉淀。粗多糖沉淀冷凍干燥即得胞外粗多糖[10]。

1.2.3 胞外粗多糖的分離純化稱量20 mg粗多糖，溶解于2 mL、0.2 mol/L的NaCl溶液中，用0.22 μm孔徑的濾膜過濾后通過Sepharose CL-6B柱層析。調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動收集器收集。從每管取1 mL收集液，用苯酚硫酸法[11]于490 nm處檢測多糖，于280 nm處直接檢測收集液的蛋白質(zhì)，記錄吸光度值。然后以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，多糖和蛋白質(zhì)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制粗多糖的分離純化圖。重復(fù)過層析柱8～10次，將同一組分的多糖收集在一起，濃縮后用截留相對分子質(zhì)量為3 500的透析袋透析3 d，每天換蒸餾水3次。最后將透析過的精制胞外多糖冷凍干燥，置干燥器中備用。

1.2.4 凝膠過濾法測胞外多糖的相對分子質(zhì)量用0.2 mol/L NaCl溶液平衡Sepharose CL-6B層析柱24 h后，先用藍(lán)色葡聚糖2000加入柱內(nèi)測得外水體積V0，然后取2 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL的相對分子質(zhì)量不同的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖 （Dextran T10、T40、T70、T150）分別相繼上樣，調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動收集器收集。用苯酚硫酸法檢測吸光度值，合并洗脫液，分別求得洗脫體積Ve。凝膠柱所能容納的總體積定為Vt，其計(jì)算方法見公式（1）。以各標(biāo)準(zhǔn)多糖的分配系數(shù)Kav值為橫坐標(biāo)，相對分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。Kav值的計(jì)算公式見式（2）。

其中：D為層析柱直徑，h為層析柱高，Ve為洗脫體積，V0為外水體積，Vt為柱床總體積。

按上述方法測得真菌胞外多糖的Ve，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其相對分子質(zhì)量[12]。

1.2.5 精制EPS的紅外光譜（IR）測定稱取2～3 mg精制EPS，加入適量的KBr，研磨均勻后壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波長區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收值[13]。

1.2.6 精制EPS的氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）測定稱取精制EPS 3 mg，放入棕色小瓶中，加入3 mL、2 mol/L的三氟乙酸，密封后置于121℃的烘箱中恒溫2 h。冷卻后過0.22 μm的水相濾膜，將所得濾液旋蒸干后，加入3 mL甲醇再次旋蒸干，重復(fù)操作3次。最后加入1.5 mL吡啶和0.1 mL衍生試劑BSTFA∶TMCA（99∶1），密封后置于 80 ℃的烘箱中恒溫1 h，冷卻后過0.22 μm的有機(jī)濾膜，送樣檢測[14]。

上樣條件：色譜柱型號為HP-5 MS 60 m，分流比 100∶1，進(jìn)樣量 0.1 μL，延遲時間 7 min，進(jìn)樣口280，傳輸線280。升溫程序：起始溫度為60℃，保持2 min，然后以5℃/min的速度升溫至280℃，保持20 min。MS分析條件：溶劑延遲7 min，掃描范圍35～455 aum，進(jìn)樣口280℃，傳輸線溫度280℃，EI能量70 eV，離子源溫度230℃，四級桿溫度160℃。

1.2.7 SEC/MALLS測定精制EPS的絕對分子質(zhì)量及分子構(gòu)象研究表明，將尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測儀（MALLS）和示差折光檢測儀（RI）聯(lián)用，可以測定多糖的絕對分子質(zhì)量及分子構(gòu)象[15]。

用50 mmol/L NaNO3和0.02%NaN3溶解精制EPS樣品，配制成2 mg/mL的樣品溶液，用0.22 μm的水相膜過濾后備用。流速設(shè)定為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為100 μL，dn/dc值根據(jù)相關(guān)研究設(shè)為0.14 mL/g[16]。多糖的相對分子質(zhì)量和均方根旋轉(zhuǎn)半徑由軟件Astra 4.72（美國懷亞特公司）計(jì)算得出。由均方根旋轉(zhuǎn)半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線，可判斷多糖分子在水溶液中的構(gòu)象。具體條件由以下公式給出：

球形：r3i∝Mi→lgri=k+1/3lgMi

無規(guī)則卷曲：r3i∝Mi→lgri=k+1/2lgMi

剛性桿狀：r3i∝Mi→lgri=k+lgMi

其中，ri為多糖的均方根旋轉(zhuǎn)半徑；Mi為多糖的相對分子質(zhì)量；k為均方根半徑的截距；1/3、1/2和1為多糖不同構(gòu)象的臨界值。

1.2.8 精制EPS的粘度測定[17]EPS的粘度用烏氏粘度計(jì)在（25±0.1）℃的水浴中進(jìn)行測定。為了忽略動能的校正，需要選擇溶劑流出毛細(xì)管時間大于120 s的粘度計(jì)。采用逐步稀釋法按照Huggins方程（3）和 Kraemer方程（4），將濃度外推至零計(jì)算[η]：

其中，ηsp/c 為比濃粘度；lnηr/c 為比濃對數(shù)粘度；k′和β為多糖在恒定溫度下溶劑中的常數(shù)值。

1.2.9 精制EPS均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）和流體力學(xué)半徑（Rh）的測定[18]分子質(zhì)量中心到各質(zhì)點(diǎn)（基團(tuán)）距離平方的平均值的平方根被定義為均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg），它反映單個高分子分子鏈在空間的伸展程度。流體力學(xué)半徑（Rh）反映流體力學(xué)作用時大分子在溶液中的尺寸，它是一個與高聚物鏈有相同平移擴(kuò)散系數(shù)的等效球體的半徑[19]。Rg通過SECMALLS法測得，而Rh通過粘度法獲得，根據(jù)Einstein理論公式（5）Rh推算得：

其中，NA為阿伏伽德羅常數(shù) （6.022×1023）；Mw和[η]分別為重均相對分子質(zhì)量和特性粘度。

均方旋轉(zhuǎn)半徑和流體力學(xué)半徑的比值可以用ρ表示：

1.2.10 鄰二氮菲法測定EPS對·OH的清除能力

配置質(zhì)量濃度梯度分別為 2、4、6、8、10 mg/mL 的EPS溶液10 mL。取7支試管，其中5支為實(shí)驗(yàn)組，1支作為對照組，1支為調(diào)零組。向?qū)嶒?yàn)組中加入1 mL pH 7.4 磷酸緩沖液 （0.02 mmol/L，PBS），1 mL 7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液，1 mL 3.25 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1.5%H2O2，2 mL 多糖溶液[21]。其中調(diào)零組以蒸餾水替代2 mL多糖溶液，對照組以蒸餾水替代2 mL多糖溶液和1 mL 1.5%H2O2?；靹蚝?，37℃水浴1 h。調(diào)零組調(diào)零后，用紫外分光光度計(jì)于510 nm處測定實(shí)驗(yàn)組和對照組的吸光度值。每組做3次平行，取其平均值。EPS對·OH清除率的計(jì)算公式如下：

其中，Ai為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值；Aj為對照組的吸光度值。

1.2.11 EPS對·DPPH清除能力的測定配置質(zhì)量濃度梯度為 1、2、3、4、5 mg/mL 的 EPS 溶液 20 mL。取11支試管，5支為實(shí)驗(yàn)組，5支為對照組，1支為空白組。向?qū)嶒?yàn)組分別加入2 mL EPS溶液、2 mL 0.1 g/L的DPPH 50%乙醇溶液，混勻后25℃水浴1 h，以50%乙醇溶液為空白，于517 nm處測定其吸光度Bi；向空白組分別加入2 mL 0.1 g/L的DPPH 50%乙醇溶液、2 mL蒸餾水，混勻后25℃水浴1 h，測定其吸光度Bo[22]；向?qū)φ战M分別加入2 mL EPS溶液、2 mL 50%乙醇，混勻后25℃水浴1 h，測定其吸光度Bj。EPS對·DPPH清除率的計(jì)算公式如下：其中，Bi為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值；Bj為對照組的吸光度值；B0為空白組的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 楊樹桑黃EPS的分離純化

發(fā)酵罐發(fā)酵楊樹桑黃所產(chǎn)EPS經(jīng)除蛋白質(zhì)后，通過Sepharose CL-6B柱層析進(jìn)行分離純化，結(jié)果見圖1。通過分析可知，楊樹桑黃粗多糖純化時有兩個多糖吸收峰，即兩個組分（Fr-I和Fr-II）。Fr-I為12～28管，F(xiàn)r-II為29～40管，對這兩個組分的管數(shù)分別進(jìn)行收集，透析袋透析，然后冷凍干燥，即得精制多糖。而且可以看出，蛋白質(zhì)吸收峰在兩個多糖吸收峰中都有，說明其精制多糖的兩個組分均可能含有糖蛋白。

圖1 楊樹桑黃產(chǎn)EPS分離純化結(jié)果Fig.1 Separation and purification of EPS from P.vaninii Ljup

2.2 楊樹桑黃EPS的相對分子質(zhì)量

以Kav值為橫坐標(biāo)，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列的lgM值為縱坐標(biāo)，繪得相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-5.485 8x+6.537 9，相關(guān)性系數(shù)為R2=0.999 3。由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算楊樹桑黃EPS精制組分的相對分子質(zhì)量，結(jié)果見圖2。實(shí)驗(yàn)測得楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II的Ve分別為115、155 mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算得楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II的相對分子質(zhì)量分別為627 500和55 000。

2.3 楊樹桑黃EPS的紅外分析

楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II的紅外光譜見圖3。楊樹桑黃EPS Fr-I在3 289.3 cm-1有寬展圓滑強(qiáng)吸收峰，為O-H伸縮振動，說明其以分子間氫鍵為主；2 927.4 cm-1處有較強(qiáng)吸收峰，是由多糖中甲基-CH3或次甲基-CH2的C-H的伸縮振動引起的，具有典型的多糖特征；在1 736.5 cm-1處有吸收峰，說明有酯基或O-乙酰基的存在；在1 642.9 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，是N-H的變角振動，為氨基或酰胺基的結(jié)構(gòu)[23]；1 554.7 cm-1處為C=O伸縮振動；1 382.8 cm-1處的紅外吸收峰為磺酰基-O-SO2-R的S=O非對稱伸縮振動；1 129.8 cm-1處有紅外吸收峰，為C-O-C環(huán)內(nèi)醚的C-O伸縮振動；1 025.8 cm-1處的紅外吸收峰為-OH的O-H變角振動；在974.0 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，此處為吡喃環(huán)末端次甲基的橫搖振動；912.1 cm-1處的紅外吸收峰為α-吡喃糖的吸收峰；887.4 cm-1處的紅外吸收峰為β-吡喃糖的吸收峰[24]；810.5 cm-1處的紅外吸收峰為甘露糖特征吸收峰[25]。由此推測楊樹桑黃EPS Fr-I為α-和β-構(gòu)型共存的吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖[26]。其Fr-II圖譜與Fr-I不同的是沒有C-O-C環(huán)內(nèi)醚的C-O伸縮振動，917.0 cm-1處的紅外吸收峰為α-吡喃糖的吸收峰，推斷其Fr-II為α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖。

圖2 楊樹桑黃EPS精制組分的相對分子質(zhì)量Fig.2 Relative molecular weight of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

圖3 楊樹桑黃EPS精制組分的紅外光譜圖Fig.3 RT-IR spectra of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

2.4 楊樹桑黃EPS單糖組分分析

將楊樹桑黃EPS的各精制組分分別進(jìn)行GC/MS檢測，把各個組分的氣相色譜圖中每個峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間進(jìn)行比對。分別對楊樹桑黃EPS精制組分的氣相色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 楊樹桑黃EPS精制組分氣相色譜圖Fig.4 GC of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

采用面積歸一化法對楊樹桑黃EPS單糖組分進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。其Fr-I和Fr-II所含單糖組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：核糖1.45%、1.92%，木糖2.52%、3.86%，葡萄糖醛酸40.31%、20.89%，半乳糖1.68%、7.09%，葡萄糖 1.90%、14.79%，甘露糖50.24%、36.15%，半乳糖醛酸 1.89%、15.32%，兩個組分所含單糖組分的種類一樣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)有差異。楊樹桑黃EPS各精制組分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，說明發(fā)酵所得的EPS可能為酸性多糖[26-27]，與其紅外光譜分析結(jié)果一致；其單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致。

2.5 楊樹桑黃EPS的SEC/MALLS分析

采用尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測器（MALLS）和示差折光檢測器（RI）聯(lián)用技術(shù)，可檢測楊樹桑黃EPS精制組分的相對分子質(zhì)量及其在水溶液中的分布情況，結(jié)果見表2。

表1 楊樹桑黃EPS單糖組分分析Table 1 Carbohydrate composition analysis of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

表2 楊樹桑黃EPS精制組分SEC/MALLS測試結(jié)果Table 2 SEC/MALLS results of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

表 2 中 ，Mn、Mw、Mz、Mw/Mn、Rn、Rw和 Rz依 次 分別為數(shù)均相對分子質(zhì)量、重均相對分子質(zhì)量、平均相對分子質(zhì)量、多分散系數(shù)、數(shù)學(xué)均方旋轉(zhuǎn)半徑、質(zhì)量均方旋轉(zhuǎn)半徑和均方旋轉(zhuǎn)半徑的均值。

由表2數(shù)據(jù)可知，楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II的重均相對分子質(zhì)量分別為4.746×106和2.469×105，Mw/Mn即多分散系數(shù)分別為1.537和 4.715，表明兩個組分的分散性均很低，即在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小。楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II的均方根半徑分別為 22.0、12.8 nm，F(xiàn)r-I和Fr-II的均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線的斜率分別為0.10和0.16，說明其在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體。通過SEC/MALLS測得楊樹桑黃產(chǎn)EPS Fr-I和Fr-II的相對分子質(zhì)量均大于凝膠過濾法測得的相對分子質(zhì)量，這可能是因?yàn)榫贫嗵墙?jīng)過透析時多糖分子發(fā)生了聚集，溶解度降低所致。楊樹桑黃產(chǎn)EPS精制組分Fr-I（左）和Fr-II（右）的均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線見圖5。

圖5 楊樹桑黃EPS精制組分均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線Fig.5 Double logarithmic curve of root mean square radiusvsmolecularweightforrefined EPS fractions from P.vaninii Ljup

2.6 楊樹桑黃EPS的分子構(gòu)象分析

楊樹桑黃EPS分子構(gòu)象的參數(shù)見表3。其中Mw和Rg值通過SEC-MALLS法測得，而Rh通過粘度法獲得，根據(jù) Einstein理論公式推算得。粘度由烏氏粘度計(jì)測定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水的體積。通常認(rèn)為，粘度越小，多糖越具有比較致密的構(gòu)象[28]。由表3可知，實(shí)驗(yàn)測得楊樹桑黃EPS Fr-I的粘度值較Fr-II小，說明其鏈未舒展開，結(jié)構(gòu)較為致密。而且相對分子質(zhì)量相對較大的EPS精制組分測得的粘度值相對較小，這可能是因?yàn)镋PS發(fā)生了聚集，在水溶液中的溶解度不高，其構(gòu)象呈高支化的多糖聚集體，該結(jié)果與SEC-MALLS中均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線斜率的分析結(jié)果一致。

k′值在0.3～0.5時，表明該溶液對聚合物是良溶劑。由表3可知，楊樹桑黃EPS各精制組分的k′均大于0.5，說明其在水溶液中的溶解性較低。Rg和Rh的比值為ρ，ρ值可以用來描述多糖分子在水溶液中的鏈構(gòu)象。ρ≈0.3時，為均一緊密的球形構(gòu)象；ρ≈0.5時，為一個松散連接的超支化鏈或聚合物；ρ≈1時，為剛性桿狀鏈。楊樹桑黃EPS各精制組分的ρ值均接近于1，說明其EPS各精制組分在水溶液中可能為剛性鏈狀的多糖聚集體。

表3 楊樹桑黃EPS精制組分的分子構(gòu)象參數(shù)Table 3 Molecular conformation parameters of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

2.7 楊樹桑黃EPS的抗氧化活性分析

楊樹桑黃EPS對·OH和·DPPH自由基的清除率見圖6。當(dāng)楊樹桑黃EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其對·OH自由基的清除率高達(dá)38.58%，而當(dāng)楊樹桑黃EPS質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，其對·DPPH自由基的清除率已高達(dá)59.17%。其EPS對·DPPH自由基的清除率明顯高于其對·OH自由基的清除率，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。

圖6 楊樹桑黃EPS精制組分對·OH和·DPPH自由基的清除率Fig.6 ·OH and·DPPH radical scavenging rate of refined EPS fractions from P.vaninii Ljup

3 結(jié) 語

研究表明，楊樹桑黃EPS含有兩個組分，F(xiàn)r-I和Fr-II的相對分子質(zhì)量分別為627 500和55 000。紅外分析可知，其EPS具有明顯的多糖特征吸收峰，其Fr-I為α-和β-構(gòu)型共存的吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖，其Fr-II為α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖。楊樹桑黃EPS Fr-I和Fr-II所含單糖組分和質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：核糖1.45%、1.92%，木糖2.52%、3.86%，葡萄糖醛酸40.31%、20.89%，半乳糖1.68%、7.09%，葡萄糖1.90%、14.79%，甘露糖50.24%、36.15%，半乳糖醛酸1.89%、15.32%，兩個組分所含單糖組分的種類一樣，質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所差異；其Fr-I和Fr-II均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，說明發(fā)酵所得EPS可能為酸性多糖，與其紅外光譜分析結(jié)果一致；其單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致。SEC/MALLS結(jié)果表明，其EPS分散性很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小，且在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體。楊樹桑黃EPS的分子構(gòu)象參數(shù)結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量較大的EPS精制組分測得的粘度值相對較小，這可能是因?yàn)镋PS發(fā)生了聚集，在水溶液中的溶解度不高，其構(gòu)象呈高支化的多糖聚集體，該結(jié)果與SEC-MALLS中均方根半徑對相對分子質(zhì)量的雙對數(shù)曲線斜率的分析結(jié)果一致；楊樹桑黃EPS的ρ值接近于1，說明其EPS在水溶液中可能為高度分支的多糖聚集體。楊樹桑黃EPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，對·OH自由基的清除率為38.58%，其質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，對·DPPH自由基的清除率高達(dá)59.17%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究楊樹桑黃EPS的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥、保健食品行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。