王志軍 ， 蔡金鑫 ， 虞椏芳 ， 錢海峰 ，張 暉 ，李 言， 吳港城， 齊希光， 王 立

（1.中糧塔原紅花（新疆）有限公司，新疆 塔城 834700；2.福建盼盼食品集團(tuán)有限公司，福建 晉江 362261；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

全世界許多國家都將面包作為日常主食。隨著全球消費者越來越關(guān)注健康問題，被認(rèn)為是天然和健康的天然酵母面包[1-2]的需求迅速增加。天然酵母是利用培養(yǎng)基質(zhì)表面附著的野生酵母和乳酸菌培養(yǎng)起始菌種，加入面粉和水混合，經(jīng)長時間發(fā)酵制成的發(fā)酵劑[3]。谷物、水果或啤酒花都可以成為制備天然酵母的原料。天然酵母是發(fā)酵食品技術(shù)中最古老的方法之一，被用于生產(chǎn)發(fā)酵焙烤食品已超過5 000年[3]。酵母菌和乳酸菌構(gòu)成了天然酵母的微生物菌群，在面團(tuán)發(fā)酵中產(chǎn)生各種有機(jī)酸和特殊風(fēng)味成分，如醇、醛和酯等，能夠賦予發(fā)酵面包獨特的風(fēng)味[4]。此外，大量研究表明，天然酵母用于面團(tuán)發(fā)酵可改善面包質(zhì)構(gòu)[5]，延長保質(zhì)期[6-7]，提高營養(yǎng)特性[8]。天然酵母可以提高無麩質(zhì)面包的品質(zhì)[9]，對霉菌有一定抑制作用，可用作生物防腐劑[10]。

目前國內(nèi)外關(guān)于天然酵母的研究大部分為谷物基質(zhì)，而關(guān)于水果基質(zhì)的天然酵母研究較少，而且從微生物角度分析天然酵母發(fā)酵對面包老化的影響相關(guān)報道較為少見。作者以梨和臍橙兩種水果為培養(yǎng)基質(zhì)，得到兩種水果天然酵母，以普通酵母面包為對照，研究了兩種水果天然酵母對儲藏期間面包的硬度、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水分活度和老化焓值的影響。本課題組前期研究[11]中已分離鑒定了兩種自然發(fā)酵天然酵母中的主要微生物種類和數(shù)量，作者通過分析不同分離菌株單獨發(fā)酵對面包老化特性的影響，探究梨組和臍橙組天然酵母中優(yōu)勢微生物對面包老化進(jìn)程的作用，以期為天然酵母的進(jìn)一步研究應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥粉：上海商委商務(wù)發(fā)展有限公司；梨、臍橙、白砂糖、鹽、牛奶：市售；即發(fā)性干酵母：安琪酵母股份有限公司；黃油和脫脂乳粉：恒天然商貿(mào)（上海）有限公司；植物乳桿菌、短乳桿菌、羅氏乳桿菌、釀酒酵母菌：作者所在實驗室前期研究[11]分離得到。

1.2 設(shè)備

電熱烤爐BOD-102：上海早苗公司電熱廠；電熱可調(diào)溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；面包攪拌機(jī)SM50、單門醒發(fā)箱SM-32S、切片機(jī)SINMAG：新麥機(jī)械（無錫）有限公司；物性測試儀TA·XT2i：英國 SMS公司；水分活度儀 FA-ST：法國GBX公司；差示掃描量熱儀Q2000：美國TA儀器公司。

1.3 天然酵母的制備

1.3.1 自然發(fā)酵天然酵母自然發(fā)酵天然酵母的制備方法參照作者所在課題組前期研究[11]。

1.3.2 單菌種天然酵母參照何曉赟[12]的方法，并作適當(dāng)修改。將前期在梨組和臍橙組天然酵母中分離得到的三株優(yōu)勢乳酸菌和一株酵母菌分別置于（37±1） ℃和 （28±1） ℃下凍融回復(fù)， 分別接種到MRS和YPD中過夜活化。將過夜活化后的菌液接種于100 mL滅菌液體培養(yǎng)基中，接種體積分?jǐn)?shù)2%，擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。將擴(kuò)培后的菌液于5 000 r/min、4℃下離心10 min，收集菌體。去上清液后用無菌水洗滌兩次，并離心。去掉上清液，重懸。將上述菌液用無菌水稀釋至相同濃度，再將其分別接種至面團(tuán)，使得面團(tuán)中的菌量保持在107～109cfu/g，將面團(tuán)放置在25℃下培養(yǎng)12 h，得到單菌種天然酵母。

1.4 面包的制備

按照表1的配方進(jìn)行面包的制備，和面工序為將奶油以外的成分低速攪動3 min，高速攪動4～5 min，轉(zhuǎn)為低速，加入奶油，低速攪動 1～2 min，轉(zhuǎn)為高速攪動1～2 min。和面完成后，將面團(tuán)表面整理光滑，室溫下發(fā)酵110 min。然后將面團(tuán)分割成75 g/份，分成12等份，搓圓整型，靜置30 min后進(jìn)行兩次搟卷整型，放入土司模具盒。在溫度38℃，濕度80%的醒發(fā)箱中醒發(fā)80 min。烤箱180℃預(yù)熱30 min，最后面包的焙烤溫度為上火180℃，下火200℃，時間28 min。

1.5 面包硬度的測定

面包的全質(zhì)構(gòu)參數(shù)測定參考AACC 74-09（1999）標(biāo)準(zhǔn)測試方法[13]。將面包用切片機(jī)進(jìn)行均勻切片，每片厚度為12.5 mm，取中間兩片測定全質(zhì)構(gòu)，每組樣品重復(fù)測定6次。測定參數(shù)為：P/36R柱塞式探頭，測定速率1.5 mm/s，應(yīng)變力5 g，應(yīng)變程度50%，兩次壓縮間隔5 s。

1.6 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

將面包樣品密封保存在4℃下，保存1、3、5、7 d后取面包芯，面包表皮和皮下1 cm處的面包按照國標(biāo)GB/T 5009.3—2016的方法直接干燥法測定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，每組重復(fù)測定3次。

1.7 水分活度的測定

水分活度是利用水分活度儀FA-ST進(jìn)行測定，每組重復(fù)測定3次。

1.8 老化焓值的測定

參照Torrieri等人[14]的方法，將面包樣品儲藏在4℃下，保存1、7 d后取面包芯10 mg，利用DSC量熱儀進(jìn)行面包老化焓值的分析。溫度范圍為20～120℃，以10℃/min的速率升溫。用TA軟件分析面包的老化焓值，每組重復(fù)測定2次。

1.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果的表達(dá)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件和Excel進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，顯著性水平設(shè)定在5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然酵母發(fā)酵對面包儲藏期間硬度變化的影響

從圖1天然酵母對儲藏期間面包硬度的影響可以看到，3組面包樣品隨著儲藏時間的加長，面包芯硬度均逐漸加大。造成這個現(xiàn)象的一部分原因是在儲藏期間，面包中的水分有所損失。另一方面則是面包中的淀粉隨著時間的流逝逐漸老化回生，使得面包硬度逐漸增大。對照組面包（CB）在儲藏3 d后的硬度比1 d的硬度增長了64.14%，而梨組天然酵母面包（PSB）和臍橙組天然酵母面包（OSB）分別增加了6.40%和10.12%。這表明在儲藏初期，兩組天然酵母的使用均顯著延緩了面包的硬度增長（p＜0.05）。PSB和OSB硬度增長幅度最大的時間段為儲藏3～5 d，在這時間段內(nèi) PSB的硬度增長了25.38%，OSB的硬度增長了28.44%。儲藏7 d后，CB的硬度增長為儲藏前的兩倍，而PSB和OSB分別增長了56.16%和47.66%。這個增長趨勢與張薇[15]的研究結(jié)果一致，表明天然酵母發(fā)酵能延緩面包硬度的增長趨勢。

圖1 天然酵母對儲藏期間面包硬度的影響Fig.1 Influences of sourdough on the hardness of breads during storage

2.2 天然酵母發(fā)酵對面包儲藏期間水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化的影響

面包從進(jìn)烤箱開始到儲存過程中一直在發(fā)生水分的遷移進(jìn)程，特別是儲存過程的水分遷移與面包的老化息息相關(guān)。在烘烤過程中，面包的表皮最先接觸高溫，使得水分因高溫氣化而損失，表皮到面包芯的溫度呈梯度降低，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)則呈梯度上升。水分由高梯度的面包芯逐漸往低梯度的面包外皮轉(zhuǎn)移。烘烤結(jié)束后冷卻過程，隨著外界溫度的降低，這個遷移過程進(jìn)入了一個緩沖期。儲存期間，雖然水分的遷移速率得到減緩，但由于梯度效應(yīng)的存在使得水分遷移過程仍在繼續(xù)。

圖2為儲藏期間天然酵母面包各部分的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)圖。從圖中可知，面包表皮的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著儲存時間的延長而逐漸上升，1～3 d內(nèi)面包皮的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長速率和表皮1 cm處的水分減少速率較快，面包芯的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低速率較慢。這是因為表皮1 cm處和面包外皮的水分梯度大且距離近，故水分遷移較快，而面包芯和表皮1 cm處的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)差距相對較小，遷移速率較為緩慢。孫銀鳳等[16]也對酸面團(tuán)面包老化過程中的水分遷移提出了相似的推測。隨著時間的延長，面包表皮和表皮1 cm處的水分梯度減小，而面包芯與表皮1 cm處的水分梯度加大，面包表皮的水分增長進(jìn)展減緩，而面包芯的水分降低速率加快。與CB相比，兩組天然酵母面包中各處水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化速率均相對緩慢，這與圖1中面包硬度變化趨勢形成對應(yīng)。這個現(xiàn)象表明，天然酵母對抑制面包內(nèi)的水分重新分布有積極作用[17]，因此天然酵母的使用可延緩面包芯在儲藏期間的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)損失。此外，有研究表明，天然酵母中乳酸菌的代謝物（有機(jī)酸和胞外多糖）對水分和面包之間的相互作用也會有所影響[19]。

圖2 儲藏期間天然酵母面包各部分的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.2 Moisture of breads during storage

2.3 天然酵母發(fā)酵對面包儲藏期間水分活度變化的影響

面包在焙烤過后的銷售期間發(fā)生老化，使得面包硬化，感官品質(zhì)變差，是造成企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要因素之一。眾所周知，水分活度（Aw）測定的是自由水。淀粉回生是指淀粉分子從雜亂無序的狀態(tài)重新回復(fù)到井然有序的狀態(tài)[18]。在淀粉回生過程中，淀粉分子與水分子發(fā)生結(jié)合，一部分自由水變成結(jié)合水，因此體系內(nèi)的Aw會發(fā)生變化。從圖3可知，CB的Aw在儲藏過程中隨著天數(shù)的增加而降低，與PSB和OSB相比，變化趨勢較為顯著。這個現(xiàn)象說明CB在儲存期間一部分自由水與淀粉發(fā)生結(jié)合，淀粉回生。天然酵母面包的Aw則基本保持穩(wěn)定或略有減少，說明天然酵母對面包的老化具有一定的延緩作用。這個現(xiàn)象與萬晶晶[19]得到的水活變化趨勢相似。

圖3 儲藏期間天然酵母面包的水分活度Fig.3 Water activity of breads during storage

2.4 天然酵母發(fā)酵對面包儲藏期間老化焓值的影響

圖4為三組面包樣品在4℃下儲藏1 d和7 d后的老化焓值。淀粉回生是導(dǎo)致面包硬化的主要影響因素[20]。儲藏1 d后CB的老化焓值為1.091 0 J/g，PSB的老化焓值比CB降低了27.27%，OSB降低了20.03%。儲藏7 d后，CB的老化焓值增長到2.300 5 J/g，而PSB的老化焓值僅為CB的76.01%，OSB的老化焓值僅為CB的80.66%。天然酵母對面包老化的延緩作用，是因為天然酵母的酸性環(huán)境，較低的pH會抑制淀粉的回生過程。另外文獻(xiàn)[21]認(rèn)為，天然酵母中的乳酸菌可以分泌胞外淀粉酶，淀粉酶可將大分子淀粉水解成小分子糊精，糊精可阻礙淀粉和水結(jié)合，對淀粉的回生過程有抑制作用。乳酸菌在新陳代謝中分泌的天然膠體——胞外多糖，對面包的老化也有影響[22]。Katina等[23]通過研究麩皮制備天然酵母發(fā)酵對面包老化的影響，發(fā)現(xiàn)天然酵母對高纖維面包的老化焓值增長具有弱化作用。

圖4 儲藏期間面包的淀粉回生焓值Fig.4 Starch retrogradation enthalpy changes of bread during storage

2.5 不同菌種發(fā)酵對面包老化特性的影響

兩組天然酵母的使用顯著延緩了面包的老化進(jìn)程，猜測天然酵母中的乳酸菌對延緩效果有顯著作用。因此通過分析不同分離菌株發(fā)酵條件下面包在儲藏期間水分遷移和老化焓值變化，研究乳酸菌和酵母菌單獨發(fā)酵對面包老化品質(zhì)的影響。

2.5.1 水分遷移圖5顯示了儲藏期間不同菌種面包的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 從圖 5（a）～（c）中可看到，面包表皮的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著儲藏時間的延長而不斷增長，儲藏7 d后，五組樣品的面包表皮的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別增長了 30.91%、17.92%、16.56%、16.31%和15.50%，且增長速率最大的時間段均為3～5 d。皮下1 cm處的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)略有下降，而面包芯的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著天數(shù)的增長而顯著下降。五組樣品的面包芯水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了9.95%、6.06%、6.47%、6.85%和5.43%。五組樣品中，植物乳桿菌組的增長幅度和下降幅度均相對較小。這個現(xiàn)象表明菌種類型對儲藏期間面包水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢影響不大。從圖5（d）中可以看到，乳酸菌和酵母菌單獨發(fā)酵對面包儲藏期間Aw的影響存在一定差異。CB和釀酒酵母LY4兩組的Aw在儲藏期間均呈下降趨勢，下降了3.48%左右，而三組乳酸菌組的Aw則變化趨勢不大。表明乳酸菌的存在是影響天然酵母對面包老化的延緩作用的主要因素。這與Corsetti等人[24]的結(jié)果保持一致。Jonkuviene等人[10]也報道稱乳酸菌發(fā)酵是一種可以延緩面包老化和抑制微生物腐敗的天然有效的方法。

2.5.2 老化焓值圖6為不同菌種發(fā)酵面包在4℃下7 d后的老化焓值。從圖中看到，儲藏7 d后，CB的老化焓值為2.300 5 J/g，釀酒酵母組為單一酵母菌株發(fā)酵，因此該組的老化焓值與CB的沒有顯著性差異（p＞0.05）。3種乳酸菌單獨發(fā)酵對面包的老化焓值均有一定的降低作用，這個現(xiàn)象也說明了天然酵母對面包老化的延緩主要是乳酸菌發(fā)酵在發(fā)揮作用。羅氏乳桿菌組的老化焓值比CB組降低了14.85%，短乳桿菌組和植物乳桿菌組分別降低了29.15%和14.54%。短乳桿菌對面包老化焓值增長的延緩作用更有效果。該結(jié)果證實了乳酸菌在天然酵母抑制面包老化的過程中有著不可或缺的作用，推測乳酸菌對面包老化的延緩作用是通過酸性環(huán)境抑制淀粉回生過程和分泌的胞外多糖的保水作用，乳酸菌分泌的淀粉酶對延緩老化也有一定的影響。張薇等人[25]也將天然酵母延緩面包老化歸因于體系中乳酸菌的存在。

圖5 儲藏期間不同菌種面包的水分遷移Fig.5 Moisture of breads produced with different strains during storage

圖6 儲藏7 d后不同菌種面包的淀粉回生焓值Fig.6 Starch retrogradation enthalpy of bread after storage

萬晶晶[21]發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌天然酵母發(fā)酵的燕麥面包對儲藏過程中的老化焓值增長有顯著的延緩作用。Corsetti等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌和釀酒酵母協(xié)同培養(yǎng)的天然酵母發(fā)酵對儲藏過程中面包的硬度增長有一定的延緩效果，硬度增長速率比普通酵母面包顯著降低，老化焓值的增長也較為緩慢。他們同樣推測原因是乳酸菌發(fā)酵可通過分泌的活性代謝物延緩面包在貯藏過程中的水分遷移過程，從而抑制面包的老化。乳酸菌發(fā)酵創(chuàng)造的酸性環(huán)境也會抑制淀粉的重結(jié)晶過程。此外，由于pH的降低，面粉的內(nèi)源性蛋白酶和淀粉酶在合適的pH環(huán)境下活性得到了提高，降解蛋白質(zhì)大聚合體和淀粉分子，改變蛋白質(zhì)-淀粉結(jié)構(gòu)，生成的小分子糊精對抑制淀粉重結(jié)晶也有積極作用。

3 結(jié) 語

天然酵母發(fā)酵能延緩面包硬度的增長趨勢，儲藏7 d后，CB的硬度增長為原來的兩倍，而PSB和OSB分別增長了56.16%和47.66%。天然酵母發(fā)酵能夠減緩面包在儲藏期間水分的損失，降低淀粉的回生焓值，其中儲藏7 d后PSB的淀粉回生焓值為CB的76.01%，OSB的淀粉回生焓值為CB的80.66%。乳酸菌發(fā)酵對減緩水分損失和抑制淀粉回生焓值的增長有積極影響，其中短乳桿菌單獨發(fā)酵對延緩面包老化有顯著效果。因此，推測本研究所用天然酵母中共存的乳酸菌是其改善面包儲藏品質(zhì)、延緩老化的重要因素，后續(xù)還將進(jìn)一步就天然酵母中的乳酸菌存在情況開展相關(guān)研究。