汪文倫， 牟 云， 胡夢(mèng)薇， 許萬(wàn)云， 嚴(yán) 國(guó)， 王會(huì)敏， 高劍峰

（石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

沙漠微藻的研究開始于20世紀(jì)80年代末。有研究表明，在新疆沙漠中生長(zhǎng)著百余中藻類，小球藻是其重要的組成部分[1]。小球藻（Chlorella）是一種單細(xì)胞綠藻，富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、食用纖維、微量元素和其它生物活性物質(zhì)[2]。有研究表明，通過(guò)基因工程手段和誘導(dǎo)條件，它能夠積累大量的油脂酸和藻蛋白[3-5]。因此，小球藻的研究和開發(fā)應(yīng)用越來(lái)越受到重視。采用基因工程技術(shù)優(yōu)化小球藻的油脂酸和藻蛋白合成具有重要的科學(xué)意義和巨大的應(yīng)用價(jià)值，然而對(duì)小球藻而言，還缺乏有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，成功轉(zhuǎn)化的報(bào)道只有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[6]，尚沒(méi)有報(bào)道沙漠小球藻的電擊轉(zhuǎn)化法的優(yōu)化研究。

在遺傳轉(zhuǎn)化中根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法常用于酵母和植物細(xì)胞中[7]，而微藻細(xì)胞中常用電轉(zhuǎn)化法，并且操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、過(guò)程易于控制，在適當(dāng)?shù)碾娹D(zhuǎn)化條件下對(duì)細(xì)胞的傷害小，電轉(zhuǎn)效率高。目前，電擊轉(zhuǎn)化也是一種比較成熟轉(zhuǎn)化方式并成功的應(yīng)用于等 鞭 金 藻 （Isochrysis sp）[8]、 小 球 藻 （Chlorella vulgaris）[9]、 魚 腥 藻 （Anabaena）[10]、 斜 生 柵 藻（Scenedesmus obliquus）[11]、 杜 氏 鹽 藻 （Dunaliella sallina）[12]和萊茵衣藻 （Chlamydomonas reinhardtii）[13-14]、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）[15]等，并且獲得了穩(wěn)定的外援基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。有文獻(xiàn)表明[16]，電擊后細(xì)胞存活率＜50%時(shí)，在雨生紅球藻細(xì)胞中能實(shí)現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。

作者以小球藻為實(shí)驗(yàn)材料，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入質(zhì)粒pCAMBIA2300。質(zhì)粒pCAMBIA2300上含有人乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）和 GFP 以及卡那霉素基因，即pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS。為了檢測(cè)質(zhì)粒pCAMBIA2300是否導(dǎo)入到小球藻細(xì)胞中，采用單菌落PCR和熒光倒置顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。為了有利于沙漠微藻轉(zhuǎn)基因工程改進(jìn)，作者研究了主要電擊參數(shù)和相關(guān)因子對(duì)小球藻存活和轉(zhuǎn)化效率的影響，從而建立電轉(zhuǎn)化體系，以期待指導(dǎo)小球藻的成功轉(zhuǎn)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙漠小球藻GTD8A1：作者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定獲得，采用的培養(yǎng)基為BBM。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻液，按照10%的接種體積分?jǐn)?shù)接種。培養(yǎng)條件：25℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度：4 000 Lx，光照周期為光/暗=12 h/12 h靜止培養(yǎng)，每三天手動(dòng)搖晃一次。

質(zhì)粒pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS的大小為10 kb左右，由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存，在E.coliDH5α培養(yǎng)擴(kuò)增，采用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取純化。質(zhì)粒pCAMBIA2300含有人乳鐵蛋白（human lactoferrin，HLF）和GFP以及卡那霉素基因，質(zhì)粒濃度采用紫外分光光度計(jì)儀測(cè)定。

主要試劑：山梨醇、甘露醇和HEPES均購(gòu)自上海生工；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根；卡那霉素（Kanamycin，Kan）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：熒光倒置顯微鏡、電擊轉(zhuǎn)化和PCR儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-HLFOCS驗(yàn)證通過(guò)含有抗性的LB培養(yǎng)基將E.coliDH5α擴(kuò)增24 h后，采用質(zhì)粒小提試劑盒將質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-GFP-HLF-OCS提取，采用HLF和GFP引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，同時(shí)送樣測(cè)序驗(yàn)證。

PCR （Polymerase Chain Reaction） 反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL， 單克隆變性液 2 μL， 引物 （GFP-F/GFP-R；HLF-F/HLF-R）2 μL，2×Taq PCR MasterMix（TaKaRa，China） 8 μL，共 20 μL 擴(kuò)增體系。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94 ℃ 30 sec，55 ℃ 30 sec，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；72℃10 min。 擴(kuò)增后的目的條帶約750 bp，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 變性 60 s，62℃退火 40 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增后的目的條帶約2 133 bp，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

沙漠小球藻GT8A1所用的BBM培養(yǎng)基：NaNO3250 mg/L，KH2PO4175 mg/L，K2HPO475 mg/L，MgSO4·7H2O 75 mg/L，CaCl2·2H2O 25 mg/L，NaCl 25 mg/L，EDTA 50 mg/L，KOH 31 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 4.98 mg/L，H3PO411.42 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.82 mg/L，MnCl21.44 mg/L，MoO30.71 mg/L，CaSO4·5H2O 1.57 mg/L，Co（NO3）2·6H2O 0.49 mg/L，98%H2SO42 μL/L。（可以在以上組份中加入15～20 g瓊脂，加入蒸餾水補(bǔ)至1 L制成固體培養(yǎng)基，121℃滅菌20 min，4℃保存）。

E.coliDH5α所用的LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化鈉 10 g/L（加去離子水溶解至終體積1 L，用2 mol/L NaOH調(diào)pH值7.0～7.4之間；同時(shí)加入15～20 g瓊脂粉，制成固體培養(yǎng)基；在121℃高壓下滅菌20 min，4℃保存）。

1.2.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定小球藻采用BBM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，接種后的細(xì)胞濃度為3.2×105個(gè)/mL，設(shè)置3個(gè)平行樣，每隔兩天取樣一次，進(jìn)行細(xì)胞OD680檢測(cè)。

1.2.3 電擊轉(zhuǎn)化過(guò)程 取不同培養(yǎng)時(shí)間的小球藻細(xì)胞3～5 mL（細(xì)胞數(shù)量控制在 1×108個(gè)/mL），在5 000g/min離心5 min，收集小球藻細(xì)胞后再用無(wú)菌的BBM培養(yǎng)基清洗3次，然后分別在5 000﹑4 000、3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細(xì)胞；將收集好的小球藻細(xì)胞置于不同濃度的高滲溶液中（甘露醇、山梨醇各100 μL），在冰上處理不同的時(shí)間，然后3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細(xì)胞，去掉上清液，在沉淀中加入pH 7.2的不同濃度HEPS電擊緩沖液 （取23.8 g HEPES溶于90 mL雙蒸水中，用2 mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0～8.0，然后用蒸餾水定容至100 mL，過(guò)濾除菌，分裝成2 mL/瓶，4℃保存），將藻細(xì)胞稀釋成1×108個(gè)/mL放置冰上備用；用紫外光處理干凈的電擊杯30 min左右，將其放置在冰上備用；按藻細(xì)胞：質(zhì)粒（不同濃度的質(zhì)粒）=3∶1的比例混勻樣本加入到電擊杯中，在冰上放置10 min后，在電擊儀上電擊，在不同的電壓條件下電擊，持續(xù)時(shí)間0.2 s，脈沖距離2 mm；電擊后的藻細(xì)胞置于含有3 mL復(fù)活培養(yǎng)基的六孔版中，在黑暗的條件下復(fù)活24～48 h后，一部分用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞的存活率；一部分在7 000g/min離心1 min收集轉(zhuǎn)化小球藻細(xì)胞，再用無(wú)菌的BBM培養(yǎng)基清洗3次，然后分別再5 000﹑4 000、3 000g/min離心收集比較干凈的小球藻細(xì)胞，一部分用無(wú)菌的ddH2O稀釋后在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光和計(jì)數(shù)，一部分涂布于含有100 mg/L卡那霉素的BBM固體平板上，篩選單克隆。培養(yǎng)4～6周后會(huì)有單克隆長(zhǎng)出，然后將平板上所長(zhǎng)的單克隆用無(wú)菌的牙簽挑起后置于10 μL的ddH2O中，95℃預(yù)變性后作為PCR反應(yīng)的模板，用PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆，PCR條件同上。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別以不同的電壓、培養(yǎng)周期、滲透劑濃度、滲透時(shí)間、質(zhì)粒濃度和電擊緩沖液濃度為單因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定正交實(shí)驗(yàn)變量的設(shè)計(jì)范圍。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取單因素實(shí)驗(yàn)最適的范圍，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)表以獲取最佳的電轉(zhuǎn)優(yōu)化體系，結(jié)果見(jiàn)表1。

續(xù)表1

1.2.6 分析方法將所有電擊轉(zhuǎn)化后的小球藻細(xì)胞24 h復(fù)活后，通過(guò)梯度離心獲得細(xì)胞，用400 μL培養(yǎng)基重懸，取100 μL做細(xì)胞計(jì)數(shù)和熒光倒置顯微鏡計(jì)數(shù)；然后將300 μL細(xì)胞懸液涂布于3個(gè)平行的抗性篩選平板中，培養(yǎng)4～6周后有單克隆長(zhǎng)出，用滅菌的牙簽挑取單克隆做菌落PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

PCR （Polymerase Chain Reaction） 反應(yīng)體系：ddH2O 8 μL， 單克隆變性液 2 μL， 引物 （HLF-F/HLF-R）2 μL，2 ×Taq PCR MasterMix （TaKaRa，China） 8 μL，共 20 μL 擴(kuò)增體系。

PCR（Polymerase Chain Reaction）反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min；95℃ 變性 60 s，62℃退火 40 s，72℃延伸2.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增后的目的條帶約2 133 bp，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

采用PCR手段對(duì)遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)：本實(shí)驗(yàn)將獲得的轉(zhuǎn)化藻株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔兩個(gè)月提取其RNA反轉(zhuǎn)錄后采用PCR技術(shù)驗(yàn)證目的基因（HLF）是否存在，來(lái)證明其遺傳穩(wěn)定性。其中RNA的提取按照TRIZOL的說(shuō)明書進(jìn)行；反轉(zhuǎn)錄采用TAKARA的試劑盒進(jìn)行，操作按說(shuō)明書進(jìn)行；PCR反應(yīng)體系同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-HLF-GFPOCS鑒定及其熒光表達(dá)

采用PCR和熒光倒置顯微鏡對(duì)構(gòu)建的載體進(jìn)行驗(yàn)證和表達(dá)，通過(guò)PCR獲得HLF和GFP目的基因，其目的條帶大小為2 133 bp和750 bp，見(jiàn)圖1（a）。通過(guò)熒光倒置顯微鏡證明了GFP能在小球藻細(xì)胞中表達(dá)，其中綠色為含有GFP的小球藻細(xì)胞，紅色為不含GFP的小球藻細(xì)胞，見(jiàn)圖1（b）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，質(zhì)粒載體可以用于下面的實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 質(zhì)粒載體pCAMBIA2300-35S-HLF-GFP-OCS鑒定及其熒光表達(dá)Fig.1 Plasmid vector of pCAMBIA2300-35S-HLFGFP-OCS isdetectand expressfluorescent protein

2.2 小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

以小球藻細(xì)胞的培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，沙漠小球藻在培養(yǎng)到第8天開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期大約為16 d左右，穩(wěn)定期22 d，在30 d左右出現(xiàn)衰亡期。

圖2 沙漠小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of desert chlorella vulgaris

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 優(yōu)化電轉(zhuǎn)擊穿電壓采用不同電壓對(duì)小球藻細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄其細(xì)胞的致死率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果求平均值,見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3?？芍?，最佳的電擊電壓為1 400 V，此時(shí)的細(xì)胞致死率為56.20%，熒光陽(yáng)性平均百分率為30.83%，PCR陽(yáng)性平均百分率為39.56%。

表2 不同擊穿電壓條件下的電轉(zhuǎn)化效率Table 2 Electrotransformation efficiency was detected in different breakdown voltage condition

圖3 不同擊穿電壓條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Experimental statistics and results charts under the different breakdown voltage conditions

2.3.2 優(yōu)化培養(yǎng)周期采用不同培養(yǎng)周期的小球藻細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄細(xì)胞的致死百分率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果求其平均值，見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4?？芍罴雅囵B(yǎng)周期為8 d，此時(shí)的細(xì)胞致死率為52.94%、熒光陽(yáng)性平均百分率為30.20%，PCR陽(yáng)性平均百分率為38.29%。

表3 不同細(xì)胞培養(yǎng)條件下的電轉(zhuǎn)化效率Table 3 Electrotransformation efficiency was examined under different microalgae cell cycle condition

圖4 不同培養(yǎng)周期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Experimental statistics and results charts under different micro-algae cell cycle condition

2.3.3 優(yōu)化滲透劑濃度采用不同滲透劑濃度對(duì)小球藻細(xì)胞滲透處理后，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄其細(xì)胞的致死率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果求平均值，見(jiàn)表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5?？芍钸m滲透劑濃度為0 mol/L，此時(shí)的細(xì)胞致死率為53.70%，熒光陽(yáng)性平均百分率為27.87%，PCR陽(yáng)性平均百分率為36.17%。

2.3.4 優(yōu)化滲透時(shí)間采用滲透劑對(duì)小球藻細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間的處理，然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄其細(xì)胞的致死率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果求其平均值，見(jiàn)表5，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6?？芍罴褲B透時(shí)間0 h，此時(shí)的細(xì)胞致死率為51.24%，熒光陽(yáng)性平均百分率為28.01%，PCR陽(yáng)性平均百分率為35.55%。

表4 不同滲透劑濃度條件下的電轉(zhuǎn)化效率Table 4 Electrotransformation efficiency was detected under different osmosis buffer concentration condition

圖5 不同滲透劑濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Experimental statistics and results charts under different osmosis buffer concentration condition

表5 不同滲透處理時(shí)間條件下的電轉(zhuǎn)效率Table 5 Electrotransformation efficiency was obtained the samepenetrant osmosistreatmentChlorella Vulgaris under different time condition

2.3.5 優(yōu)化電擊緩沖液濃度對(duì)處理好的小球藻細(xì)胞添加不同濃度的電擊緩沖液，然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄其細(xì)胞致死率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果求其平均值，見(jiàn)表6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7。可知最適電擊緩沖液濃度為0.1～0.2 mol/L，此時(shí)的細(xì)胞致死率為51.16%～53.64%，熒光陽(yáng)性平均百分率為26.35%～26.38%，PCR陽(yáng)性平均百分率為33.47%～33.81%。

圖6 不同滲透劑處理時(shí)間的實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)和結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Experimental statistics and results charts under different time of osmosis treatment condition

表6 不同電擊緩沖液濃度下的電轉(zhuǎn)化效率Table 6 Electrotransformation efficiency was obtained under different electroporation buffer concentration condition

圖7 不同電擊緩沖液濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Experimental statistics and results charts under different electroporation buffer concentration condition

2.3.6 優(yōu)化質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)處理好的小球藻細(xì)胞添加不同質(zhì)量濃度的質(zhì)粒，然后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，分別記錄其細(xì)胞的致死率、熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率，將3次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果求平均值，見(jiàn)表7，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8?？芍S著質(zhì)粒質(zhì)量濃度的增加，熒光陽(yáng)性百分率和PCR陽(yáng)性百分率都在增加，其最小值分別為22.02%和28.98%。

表7 不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度條件下的電轉(zhuǎn)化效率Table 7 Electrotransformation efficiency was detected under different plasmid concentration condition

圖8 不同質(zhì)粒質(zhì)量濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Experimental statistics and results charts under different plasmid concentration condition

2.4 正交實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)電轉(zhuǎn)體系

通過(guò)單因素水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者對(duì)各個(gè)因子選取五個(gè)水平設(shè)計(jì)了六因素五水平的正交實(shí)驗(yàn)表進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，以獲取最優(yōu)的電轉(zhuǎn)化組合。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的各因素進(jìn)行極差分析得到：最優(yōu)的電轉(zhuǎn)化組合是電壓1 400 V、培養(yǎng)周期8 d、滲透劑濃度0.2 mol/L、滲透時(shí)間為0 h、質(zhì)粒質(zhì)量濃度為6 μg/mL、電擊緩沖液濃度為0.4 mol/L，其細(xì)胞致死率為51.30%，熒光陽(yáng)性平均百分率為52.54%，PCR陽(yáng)性平均百分率為42.30%。

2.5 采用PCR手段對(duì)遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)所獲得轉(zhuǎn)化藻株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每隔兩個(gè)月取50 mL的培養(yǎng)液離心后提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后檢測(cè)其HLF的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HLF基因能在沙漠小球中傳代保存六個(gè)月以上，具有相對(duì)的遺傳穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 采用PCR手段對(duì)遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定Fig.9 Genetic stability of recombinant desert Chlorella was detected with PCR

3 結(jié) 語(yǔ)

作者優(yōu)化了小球藻電擊轉(zhuǎn)化的條件，并獲得最佳的電擊轉(zhuǎn)化條件，在該條件下獲得較高的轉(zhuǎn)化水平，其熒光平均百分率高達(dá)42.30%、PCR陽(yáng)性平均百分率高達(dá)52.54%。在整個(gè)電擊轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，通過(guò)細(xì)胞的預(yù)處理和轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的恢復(fù)，利用PCR技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)獲得比較成功的轉(zhuǎn)化體系，而該體系也在其他藻類中被證明。

電擊轉(zhuǎn)化參數(shù)是轉(zhuǎn)化過(guò)程中最主要的影響因素之一，例如像細(xì)胞的細(xì)胞壁、電壓的大小、質(zhì)粒濃度的大小、細(xì)胞活力等?？朔@些影響因素的障礙主要有兩種方法。第一種就是改變細(xì)胞壁的通透性，來(lái)增加質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞的幾率。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，改變細(xì)胞壁的通透性可以增加電轉(zhuǎn)化的效率，特別是在甘露醇、山梨醇和HEPES[17-19]處理細(xì)胞和在有適當(dāng)卡那霉素[20]篩選的條件下，可以獲得較高的電擊轉(zhuǎn)化效率。第二種方法就是施加高電壓的脈沖，這種方法可以增加細(xì)胞膜的通透性從而有效的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體。我們結(jié)合這兩種解決方法的影響因素，進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電壓、細(xì)胞培養(yǎng)周期、滲透劑濃度和滲透時(shí)間等對(duì)電轉(zhuǎn)化效率起到重要作用。

細(xì)胞成功轉(zhuǎn)化的另一個(gè)主要的影響因素是細(xì)胞的生長(zhǎng)階段，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入到對(duì)數(shù)期時(shí)，細(xì)胞對(duì)電壓特別靈敏，容易受到電壓的電擊而死亡，但是存活下來(lái)的細(xì)胞卻有較高的轉(zhuǎn)化率[21]。為了證實(shí)生長(zhǎng)周期對(duì)電擊轉(zhuǎn)化的電轉(zhuǎn)化效率都要比對(duì)數(shù)期的要低，而在對(duì)數(shù)期時(shí)間段中，對(duì)數(shù)前期的電轉(zhuǎn)化效率比對(duì)數(shù)后期要高。考慮到這過(guò)問(wèn)題，我們?cè)谵D(zhuǎn)化細(xì)胞的后期培養(yǎng)過(guò)程中加入卡那霉素進(jìn)行培養(yǎng)而獲得最大的電擊轉(zhuǎn)化效率。

有研究[22]表明，電轉(zhuǎn)化需要較高濃度的滲透體系，例如用山梨醇、甘露醇處理細(xì)胞可以明顯地改善細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。我們利用山梨醇和甘露醇的混合滲透體系，在0.1～0.2 mol/L之間都獲得30%以上的轉(zhuǎn)化效率。在有相同濃度的HEPES電擊緩沖液條件下，電擊轉(zhuǎn)化效率也能達(dá)到30%以上。這很可能是山梨醇、甘露醇和HEPES對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化提供保護(hù)，降低了電擊電壓對(duì)細(xì)胞的損傷幾率，這與以往在其他物種上的研究結(jié)果相似[8，23-25]。試驗(yàn)中使用滲透緩沖液和電擊緩沖液處理了電擊體系，增加了轉(zhuǎn)化效率，也保證了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在不同的滲透劑濃度和不同的滲透處理時(shí)間上，細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率隨濃度和時(shí)間的改變呈遞減趨勢(shì)，符合變化趨勢(shì)。而電擊緩沖液濃度處理的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率是先增加后下降最后又上升，這結(jié)果經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，質(zhì)粒質(zhì)量濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率似乎有著不一樣的敏感性，質(zhì)?？梢员惠p松的轉(zhuǎn)化進(jìn)入到細(xì)胞中。質(zhì)粒質(zhì)量濃度從2 μg/mL到10 ug/mL變化時(shí)，電轉(zhuǎn)化效率呈先上升后下降的趨勢(shì)，或者是呈下降趨勢(shì)。這可能是在電擊轉(zhuǎn)化體系中對(duì)細(xì)胞存活有一些影響而造成[26-28]。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果剛好和已報(bào)道的結(jié)果[29]相反，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是隨著質(zhì)粒質(zhì)量濃度的上升，電轉(zhuǎn)化效率也上升，造成這樣的原因可能是滲透處理過(guò)的細(xì)胞在電壓導(dǎo)流下比較容易進(jìn)入到細(xì)胞中，再者就是沒(méi)有必要進(jìn)行感受態(tài)的制備，有的報(bào)道中也證實(shí)質(zhì)粒DNA是伴隨著電流進(jìn)入細(xì)胞的[16，19，27，30-32]，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系中除含有處理細(xì)胞核質(zhì)粒DNA之外，我們還加入滲透緩沖液和電擊緩沖液，使得質(zhì)粒DNA能夠以穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化進(jìn)入到細(xì)胞中，從而獲得比較高的轉(zhuǎn)化效率。我們實(shí)驗(yàn)獲得了一個(gè)比較優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系，能夠獲得較高遺傳轉(zhuǎn)化效率的菌株。同時(shí)我們將轉(zhuǎn)化的藻株進(jìn)行傳代培養(yǎng)的遺傳穩(wěn)定性的研究，研究結(jié)果表明，HLF基因可以在轉(zhuǎn)化藻細(xì)胞中保存六個(gè)月以上。

我們首次在單細(xì)胞的沙漠小球藻上建立了比較完整的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)沙漠小球藻而言，這樣高效和可重復(fù)的轉(zhuǎn)化體系還是非常少見(jiàn)。我們?cè)谠囼?yàn)中獲得電擊轉(zhuǎn)化的最佳組合和相關(guān)的轉(zhuǎn)化體系，該體系簡(jiǎn)單、方便、節(jié)約時(shí)間，更重要的是該轉(zhuǎn)化體系可以擴(kuò)展到其他藻類遺傳轉(zhuǎn)化研究中。我們希望優(yōu)化改造的電擊轉(zhuǎn)化體系可以運(yùn)用到藻類的經(jīng)濟(jì)開發(fā)和遺傳轉(zhuǎn)化研究方面。