王麗萍, 崔雅欣, 徐 佳, 侯雨菲, 吐倫阿依·艾合買提, 王嘉琪, 王立成

(1. 吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012; 2. 吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012)

余甘子(PhyllanthusemblicaL.)是我國(guó)少數(shù)民族的常用藥材[1], 具有抗炎、 抗氧化、 降壓、 補(bǔ)益等多種生物活性, 且無(wú)明顯的毒副作用[2]. 秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans, 簡(jiǎn)稱線蟲(chóng))是一種無(wú)毒無(wú)害、 可獨(dú)立生存的線蟲(chóng). 因其個(gè)體小、 生命周期短、 繁殖迅速等特點(diǎn), 常作為模式生物廣泛應(yīng)用. 線蟲(chóng)經(jīng)歷4個(gè)階段的幼蟲(chóng)期(L1,L2,L3,L4)后變?yōu)槌审w. 其生活環(huán)境溫度恒定, 20 ℃時(shí)生命周期約為20 d. 采用尿嘧啶缺陷型大腸桿菌(EscherichiacoliOP50)培養(yǎng)線蟲(chóng), 具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、 生活周期短等優(yōu)點(diǎn). 作為第一個(gè)獲得全基因組序列的生物, 線蟲(chóng)40%以上的基因與人類基因同源, 且因其遺傳背景清楚、 個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、 生活史短、 基因組測(cè)序完成等優(yōu)勢(shì), 在遺傳與發(fā)育生物學(xué)、 衰老與壽命、 藥物篩選等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3-5]. 本文提取余甘子的活性成分, 并以線蟲(chóng)為模型考察其抗氧化作用.

1 材料與方法

1.1 儀 器

生化培養(yǎng)箱(SHP-160型, 上海三發(fā)科技儀器有限公司)； 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD型, 蘇州凈化設(shè)備有限公司)； 高速低溫離心機(jī)(Centrifuge 58-10R型, 德國(guó)Eppendorf公司)； 手動(dòng)移液器(德國(guó)Eppendorf公司)； 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-2501PC型, 日本島津公司)； 旋渦混合器(XW-80A型, 上海精科實(shí)業(yè)有限公司).

1.2 材料與試劑

缺陷型大腸桿菌； 野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(Bristol N2)； 余甘子； 胰蛋白胨, 酵母提取物(日本Gentihold公司)； 無(wú)水乙醇、 CaCl2,NaCl,MgSO4,NaH2PO4(分析純， 北京化工廠)； KCl,NaHCO3(分析純, 大連美侖生物有限公司)； 瓊脂粉、 磷酸二氫鉀、 膽固醇(分析純, 上海化學(xué)試劑公司)； 次氯酸鈉溶液(分析純, 天津南開(kāi)化工廠)； 超氧化物歧化酶測(cè)試盒(T-SOD， A001-1型, 南京建成生物工程研究所).

1.3 方 法

1.3.1 余甘子的提取和成分鑒定 參考文獻(xiàn)[6-7], 將0.8 g余甘子粉末溶于50 mL去離子水中, 充分振蕩, 37 ℃靜置過(guò)夜后, 于4 000 r/min離心8 min, 取上清液, 于8 000 r/min二次離心30 min, 合并上清液, 用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描, 設(shè)置掃描參數(shù)為200～800 nm, 用超純水調(diào)基線.

1.3.2 產(chǎn)卵量實(shí)驗(yàn) 挑取雌雄同體線蟲(chóng)進(jìn)行同期化培養(yǎng), 至L4期. 每組3只線蟲(chóng), 挑至相應(yīng)線蟲(chóng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(NGM)平板中. 在20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng), 每天更換培養(yǎng)基, 為方便和準(zhǔn)確計(jì)數(shù)蟲(chóng)卵個(gè)數(shù), 于線蟲(chóng)第一次產(chǎn)卵的3 d后計(jì)數(shù), 直至線蟲(chóng)產(chǎn)卵結(jié)束. 設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組： 對(duì)照組、ρ(余甘子)=1.0,2.0,4.0 mg/mL給藥組. 重復(fù)3次.

1.3.3 線蟲(chóng)移動(dòng)能力的測(cè)定 隨著線蟲(chóng)蟲(chóng)齡的增長(zhǎng), 當(dāng)線蟲(chóng)進(jìn)入生命晚期時(shí), 其移動(dòng)速度減慢, 參考文獻(xiàn)[8-9]測(cè)定線蟲(chóng)的移動(dòng)能力. 線蟲(chóng)的移動(dòng)情況主要分為4個(gè)等級(jí)： A級(jí)線蟲(chóng)具有正常的身體移動(dòng)能力； B級(jí)線蟲(chóng)的移動(dòng)狀態(tài)非正常或觸碰時(shí)移動(dòng)； C級(jí)線蟲(chóng)在觸碰時(shí)僅頭部擺動(dòng)； D級(jí)線蟲(chóng)已死亡. 選取同期化L4期線蟲(chóng)每組70只于相應(yīng)板中, 20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng), 每24 h轉(zhuǎn)移至新板中, 直至線蟲(chóng)全部死亡. 記錄給藥后線蟲(chóng)每日的運(yùn)動(dòng)情況, 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì).

1.3.4 壽命實(shí)驗(yàn) 挑取同期化成蟲(chóng)第一天的線蟲(chóng), 每組60只, 挑至已加藥的各組, 在20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 同期化線蟲(chóng)從卵孵化開(kāi)始記為0 d, 通常線蟲(chóng)產(chǎn)卵一般持續(xù)8 d, 所以在給藥初期即L4期, 每天將待測(cè)線蟲(chóng)更換新的NGM板, 以防止卵及幼蟲(chóng)發(fā)育而干擾測(cè)定. 待成蟲(chóng)不再產(chǎn)卵后每2 d更換一次NGM板. 用挑蟲(chóng)器輕輕觸碰線蟲(chóng), 若無(wú)任何反應(yīng), 則記為死亡線蟲(chóng). 因蟲(chóng)袋死亡或遺失的線蟲(chóng)記為丟失線蟲(chóng). 按天轉(zhuǎn)移線蟲(chóng)至新的給藥板中直至所有線蟲(chóng)死亡. 在喂食線蟲(chóng)第四天進(jìn)行壽命實(shí)驗(yàn), 每天記錄線蟲(chóng)的存活數(shù). 設(shè)置2個(gè)實(shí)驗(yàn)組： 對(duì)照組和ρ(余甘子)=1.0 mg/mL實(shí)驗(yàn)組. 重復(fù)3次.

1.3.5 H2O2氧化損傷實(shí)驗(yàn) 隨機(jī)選擇10只同期化的雌雄同體線蟲(chóng), 轉(zhuǎn)移至含有新鮮E.coliOP50的NGM平板上, 過(guò)夜. 第二天挑取成蟲(chóng), 于20 ℃培養(yǎng)3 d后, 每組選擇40只新孵化的成蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含20 mmol/L H2O2的NGM平板上, 每小時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率. 設(shè)置4個(gè)實(shí)驗(yàn)組： 空白組、ρ(余甘子)=0.5,1.0,2.0 mg/mL實(shí)驗(yàn)組, 均置于20 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)孵育, 重復(fù)3次.

1.3.6 熱激實(shí)驗(yàn) L4期線蟲(chóng)經(jīng)同期化后給藥3 d, 更換至新的NGM中, 密封后在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至線蟲(chóng)全部死亡. 每小時(shí)統(tǒng)計(jì)存活率, 以觸碰產(chǎn)生響應(yīng)的線蟲(chóng)數(shù)與線蟲(chóng)總數(shù)的比值表征. 側(cè)壁上脫水死亡的線蟲(chóng)記為丟失, 不參與統(tǒng)計(jì). 重復(fù)3次.

1.3.7 檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)量 同期化的L4期線蟲(chóng), 每組80只線蟲(chóng)正常給藥培養(yǎng), 每日轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)基表面. 20 ℃恒溫培養(yǎng)4 d后, 用M9緩沖溶液收集線蟲(chóng)于1.5 mL EP管中； 離心清洗3次, 各組線蟲(chóng)懸于0.5 mL M9緩沖溶液中； 用300 W功率超聲裂解線蟲(chóng), 每個(gè)循環(huán)時(shí)間20 s, 10～20個(gè)循環(huán)完成線蟲(chóng)裂解. 按照T-SOD測(cè)試盒(南京建成生物)說(shuō)明書(shū)要求, 一次加入應(yīng)用液、 樣品、 底物、 緩沖液并進(jìn)行充分混勻, 于37 ℃溫浴40 min后加入顯色劑, 室溫放置10 min, 采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度, 用超純水進(jìn)行基線調(diào)零, 計(jì)算活力.

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用GraphPad軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示, 采用Student’sT-test進(jìn)行顯著性檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子提取物分析

余甘子提取物的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖1所示. 由圖1可見(jiàn), 在213,270 nm處有明顯的強(qiáng)吸收峰, 表明余甘子提取物的主要成分為黃酮類化合物[6].

圖1 余甘子提取物的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.1 Results of ultraviolet whole wavelength scanning of P.emblica L.extracts

2.2 線蟲(chóng)衰老相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響 線蟲(chóng)產(chǎn)卵期從L4期至8 d齡. 實(shí)驗(yàn)從L4期開(kāi)始給藥余甘子提取物(ρ=1.0,2.0,4.0 mg/mL), 考察其對(duì)線蟲(chóng)正常生殖能力的影響[10-11]. 空白組及余甘子給藥組線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的統(tǒng)計(jì)分析如圖2所示. 由圖2可見(jiàn), 余甘子提取物在蟲(chóng)齡4～7 d均表現(xiàn)出較對(duì)照組顯著促生殖的作用, 在產(chǎn)卵期后期仍存在較明顯的促生殖作用, 且ρ(余甘子)=1.0 mg/mL給藥組顯著高于空白組的產(chǎn)卵總量； 高質(zhì)量濃度給藥組(4.0 mg/mL)存在一定程度的促生殖作用, 但與對(duì)照組差別較小, 可能是由于過(guò)高質(zhì)量濃度余甘子提取物的毒物興奮作用干擾線蟲(chóng)正常繁殖所致. 因此, 余甘子提取物可顯著提高線蟲(chóng)的日產(chǎn)卵及總產(chǎn)卵量.

2.2.2 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)移動(dòng)能力的影響 通過(guò)評(píng)價(jià)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力可直觀觀察線蟲(chóng)處于生命周期的何種時(shí)期, 并評(píng)價(jià)線蟲(chóng)衰老進(jìn)程[10-11].圖3為線蟲(chóng)給藥后第3,6,9,12天的行為能力水平變化趨勢(shì). 由圖3可見(jiàn), 與對(duì)照組相比, 給藥組未出現(xiàn)影響肌肉收縮功能的情況, 且ρ=1.0,4.0 mg/mL給藥組的線蟲(chóng)較同齡對(duì)照組行為更活躍, 死亡線蟲(chóng)較少； 中等質(zhì)量濃度(2.0 mg/mL)給藥組有一定的保護(hù)作用, 但與對(duì)照組差別較小, 進(jìn)一步表明在實(shí)驗(yàn)的給藥質(zhì)量濃度范圍內(nèi), 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)毒性作用較低.

圖2 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)產(chǎn)卵量的影響Fig.2 Effects of P.emblica L.extracts on spawning of C.elegans

a,b,c. ρ(余甘子)=1.0,2.0,4.0 mg/mL; d. 對(duì)照.圖3 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.3 Effects of P.emblica L.extracts on exercise capacity of C.elegans

2.2.3 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響結(jié)果如圖4所示. 由圖4可見(jiàn),ρ(余甘子)=1.0 mg/mL的給藥組較對(duì)照組表現(xiàn)出明顯的壽命延長(zhǎng)作用(***p< 0.001). 因此, 以ρ=1.0 mg/mL為最適質(zhì)量濃度, 考察余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)抗壓力保護(hù)作用的影響.

2.2.4 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)抗氧化損傷能力的影響 同期化的L4期線蟲(chóng)進(jìn)行ρ(余甘子)=0.5,1.0,2.0 mg/mL給藥培養(yǎng)3 d后, 統(tǒng)計(jì)分析H2O2損傷條件下線蟲(chóng)存活情況, 結(jié)果如圖5所示. 由圖5可見(jiàn), 1.0 mg/mL余甘子給藥組與對(duì)照組相比, 在H2O2損傷條件下對(duì)線蟲(chóng)有極顯著的保護(hù)作用(***p<0.001);ρ(余甘子)=0.5,2.0 mg/mL給藥組在線蟲(chóng)后期有一定的保護(hù)作用, 但與對(duì)照組差別較小.

圖4 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)壽命的影響Fig.4 Effects of P.emblica L.extracts on life of C.elegans

圖5 H2O2損傷條件下余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)存活率的影響Fig.5 Effects of P.emblica L.extracts on survival rate of C.elegans under condition of H2O2 damage

2.2.5 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)熱抵抗能力的影響 在35 ℃熱激條件下, 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)的保護(hù)作用如圖6所示. 由圖6可見(jiàn), 1.0 mg/mL余甘子提取物提高了線蟲(chóng)抗熱激能力(*p<0.05), 表明1.0 mg/mL余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)具有抗熱激誘導(dǎo)的氧化壓力保護(hù)作用.

2.2.6 SOD表達(dá)含量檢測(cè) 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)體內(nèi)SOD表達(dá)的影響如圖7所示. 由圖7可見(jiàn), 1.0 mg/mL余甘子提取物喂食線蟲(chóng)顯著高于空白對(duì)照組SOD的相對(duì)含量(**p<0.01), 表明余甘子提取物喂食線蟲(chóng)體內(nèi)的超氧化物歧化酶高表達(dá), 從而可提升對(duì)線蟲(chóng)在H2O2及熱激等氧化壓力誘導(dǎo)條件下的抗氧化保護(hù)作用.

圖6 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)熱抵抗能力的影響Fig.6 Effects of P.emblica L.extracts on heat resistance of C.elegans

圖7 余甘子提取物對(duì)線蟲(chóng)SOD表達(dá)的影響Fig.7 Effects of P.emblica L.extracts on SOD expression of C.elegans

綜上所述, 本文以余甘子為研究對(duì)象, 以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型, 考察了余甘子提取物的抗氧化作用, 通過(guò)抗衰老指標(biāo)評(píng)估表明, 余甘子提取物具有顯著的抗氧化功效. 較低質(zhì)量濃度(ρ=1.0 mg/mL)的余甘子提取物可顯著延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命, 提高線蟲(chóng)的產(chǎn)卵量、 移動(dòng)能力以及體內(nèi)酶活性, 進(jìn)而達(dá)到抗氧化的保護(hù)作用[12-13].