李 燕，王 松，王海寶，余永強(qiáng)*

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院放射科，安徽 合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，安徽 合肥 230022)

酒精對(duì)腦功能活動(dòng)的影響一直是臨床和科學(xué)研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)已有采用靜息態(tài)fMRI評(píng)價(jià)恒河猴和人類急性期酒精暴露及酒精依賴者腦功能活動(dòng)改變的研究報(bào)道[1-3]，但鮮見(jiàn)對(duì)慢性酒精暴露靜息態(tài)腦功能活動(dòng)改變的動(dòng)態(tài)過(guò)程研究。本研究建立恒河猴慢性酒精暴露模型，采用3.0T靜息態(tài)fMRI，基于分?jǐn)?shù)低頻振蕩幅度(fractional amplitude of low frequency fluctuations， fALFF)算法分析恒河猴慢性酒精暴露模型誘導(dǎo)期后腦功能活動(dòng)改變，旨在為后續(xù)動(dòng)態(tài)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性恒河猴7只[由安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)于河南省南陽(yáng)市新野縣新豫野生動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司(豫林護(hù)許準(zhǔn)[2006]21號(hào))]，年齡6～8歲，平均(7.0±1.0)歲，體質(zhì)量6.5～17.5 kg，平均(10.79±3.55)kg。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于恒溫(20℃～22℃)、恒濕(65%)的共同房間中飼養(yǎng)，單只猴籠安置，10 h光照周期(上午8∶00點(diǎn)亮)。

1.2動(dòng)物模型建立 采用Cosgrove等[4]報(bào)道的時(shí)間表程序誘導(dǎo)法建立恒河猴慢性酒精暴露模型，藥物為絕對(duì)風(fēng)味伏特加(每瓶700 ml，乙醇濃度為40%)，以蔗糖增甜，并用自來(lái)水稀釋，給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每日24 h自由口服。乙醇初始濃度為0.2 g/kg體質(zhì)量，喂養(yǎng)1周，后成倍遞增至第5周(2～5周乙醇濃度分別為0.4、0.8、1.6、3.2 g/kg體質(zhì)量)，之后按照第5周的濃度維持喂養(yǎng)，第5周喂養(yǎng)完成為誘導(dǎo)期結(jié)束。

1.3血液酒精濃度測(cè)定 誘導(dǎo)期結(jié)束后，fMRI前10 min，經(jīng)小隱靜脈抽取2 ml靜脈血，以GC 2014C氣相色譜儀(LTSJ-DW-A-001)檢測(cè)血液酒精濃度。

1.4fMRI 酒精喂養(yǎng)前行靜息態(tài)fMRI獲取基線數(shù)據(jù)，以3%戊巴比妥鈉(臀部肌肉注射，劑量1.2 ml/kg體質(zhì)量)麻醉動(dòng)物，以仰臥位保定于掃描床，監(jiān)控呼吸，進(jìn)行BOLD及3D結(jié)構(gòu)像掃描；誘導(dǎo)期結(jié)束后再行靜息態(tài)fMRI，參數(shù)同前。MR掃描前12 h停止酒精喂養(yǎng)，掃描結(jié)束后將動(dòng)物安全送回動(dòng)物房，清醒6 h后恢復(fù)飼食飼水。每次掃描前測(cè)量動(dòng)物體質(zhì)量。

采用GE Discovery 750W 3.0T MR掃描儀，頭部16通道相控陣正交線圈。BOLD數(shù)據(jù)采用單次激發(fā)EPI序列行全腦軸位掃描，TR 2 000 ms，TE 35 ms，翻轉(zhuǎn)角90°，F(xiàn)OV 24 cm×24 cm，層厚2.5 mm，層間距0.5 mm，矩陣64×64，層數(shù)26層；3D結(jié)構(gòu)像采用快速擾相梯度翻轉(zhuǎn)恢復(fù)序列行軸位掃描，TR 7.2 ms，TE 3.1 ms，翻轉(zhuǎn)角8°，F(xiàn)OV 25.6 cm×25.6 cm，層厚1.0 mm，無(wú)層間隔，矩陣256×256，層數(shù)172層。

1.5圖像處理 采用MatLab 7.12(R2011a)dpabi子軟件DPARSF 3.2和SPM12 fMRI數(shù)據(jù)處理軟件。將DICOM格式的原始圖像轉(zhuǎn)換為NIFTI格式，移除前10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行頭部運(yùn)動(dòng)校正，并將數(shù)據(jù)以Reslice_112RM-SL_T1模板標(biāo)準(zhǔn)化，重新采樣為2 mm×2 mm×2mm的體素元素；然后進(jìn)行平滑(高斯半高寬3 mm)、非線性漂移和低頻濾波處理，頻率范圍為0.01～0.08 Hz；以Friston24軟件去除協(xié)變量，包括去趨勢(shì)線、頭部運(yùn)動(dòng)參數(shù)、腦白質(zhì)、腦脊液信號(hào)等；計(jì)算和推導(dǎo)全腦fALFF值，并以MRIcron軟件顯示建模前后fALFF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腦區(qū)，并根據(jù)猴腦解剖圖和MNI坐標(biāo)確定差異腦區(qū)的具體位置[1]。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPM 12.0軟件對(duì)建模前后fALFF進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.005(非校正)及簇叢≥5個(gè)體素為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；根據(jù)MNI坐標(biāo)呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的腦區(qū)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)建模前后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)7只恒河猴均成功完成實(shí)驗(yàn)，獲得fMRI數(shù)據(jù)。建模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體質(zhì)量為(10.79±3.55)kg，酒精暴露誘導(dǎo)期后體質(zhì)量為(10.64±3.34)kg，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.795，P=0.457)。fMRI前10 min，2只動(dòng)物的血液酒精濃度分別為0.46、0.49 mg/ml，其余5只動(dòng)物的血液酒精濃度均<0.01 mg/ml。

與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導(dǎo)期后fALFF值減低的腦區(qū)包括左側(cè)額中回、左側(cè)小腦半球和左側(cè)枕下回(簇叢≥5個(gè)體素，P均<0.005)，fALFF值增高的腦區(qū)包括右側(cè)中央前回、右側(cè)額中回、右側(cè)楔葉、右側(cè)枕中回和右側(cè)小腦蚓部(簇叢≥5個(gè)體素，P均<0.005)，見(jiàn)表1、圖1。

3 討論

隨著影像學(xué)檢查設(shè)備和軟件的不斷更新，諸多新的成像方法得到開(kāi)發(fā)、應(yīng)用。靜息態(tài)fMRI的出現(xiàn)，使準(zhǔn)確描述活體大腦靜息狀態(tài)下復(fù)雜的功能結(jié)構(gòu)成為可能[5]。BOLD信號(hào)與神經(jīng)血管及血流動(dòng)力學(xué)機(jī)制密切相關(guān)，對(duì)血管活性物質(zhì)如酒精非常敏感[6-7]。低頻振蕩幅度(amplitude of low frequency fluctuations, ALFF)與區(qū)域神經(jīng)活動(dòng)成正比，而fALFF對(duì)腦灰質(zhì)更具特異性[8]，可準(zhǔn)確描述腦區(qū)的自發(fā)神經(jīng)活動(dòng)。研究[9]表明恒河猴與人類具有相似的默認(rèn)模式網(wǎng)絡(luò)(default mode network, DMN)，在麻醉狀態(tài)下仍具有完整的網(wǎng)絡(luò)連接。本研究采用靜息態(tài)fMRI BOLD信號(hào)fALFF算法對(duì)恒河猴慢性酒精暴露誘導(dǎo)期后腦功能活動(dòng)進(jìn)行觀察。

表1 與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導(dǎo)期后fALFF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腦區(qū)

圖1 與建模前比較，恒河猴酒精暴露誘導(dǎo)期后fALFF值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的腦區(qū)

酒精對(duì)靜息態(tài)腦功能的影響根據(jù)給藥方式、給藥量、給藥后檢測(cè)時(shí)間不同而具有不同的特點(diǎn)。研究[10]表明急性酒精暴露(口服酒精0.65 g/kg體質(zhì)量，10 min內(nèi)服下)后30 min，人腦DMN的ALFF、局部一致性(regional homogeneity， ReHo)和功能連接均發(fā)生改變，功能連接減弱腦區(qū)主要位于左側(cè)大腦半球，提示左側(cè)大腦半球在靜息狀態(tài)下可能對(duì)酒精損傷更敏感。本研究中，恒河猴fALFF值減低的腦區(qū)均位于左側(cè)半腦，推測(cè)慢性酒精暴露早期腦功能抑制腦區(qū)與急性酒精暴露相似，均位于左側(cè)半球。本研究中fALFF值增高腦區(qū)均位于右腦，且范圍較廣泛，涉及額葉、枕葉和小腦等，提示慢性酒精暴露早期腦功能激活具有右腦偏側(cè)化特點(diǎn)，可能與左半腦血流量減少、功能減弱，而右半腦血流量?jī)?yōu)勢(shì)代償有關(guān)，其確切機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。急性酒精暴露可特異性抑制小腦區(qū)域神經(jīng)元活動(dòng)，長(zhǎng)期大量酒精暴露的神經(jīng)病理學(xué)改變主要見(jiàn)于小腦和額葉，在青少年和年輕人的不成熟大腦中尤為明顯[11]。本研究結(jié)果顯示，在慢性酒精暴露誘導(dǎo)期后恒河猴出現(xiàn)左側(cè)小腦半球功能活動(dòng)減低，可能會(huì)影響運(yùn)動(dòng)控制。

本研究結(jié)果顯示，恒河猴雙側(cè)額葉在慢性酒精暴露誘導(dǎo)期后即出現(xiàn)功能活動(dòng)改變，左側(cè)減低，右側(cè)增加。額葉皮層參與藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制[12]，額葉與情感和需求關(guān)系密切，可能是酒精濫用甚至成癮作用的重要靶點(diǎn)。慢性酒精暴露下，額葉皮層和島葉皮層中均可觀察到α4β2煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合顯著降低[13]。本研究結(jié)果顯示，在慢性酒精誘導(dǎo)期動(dòng)物模型中，雖然酒精攝入量較低，但額葉已經(jīng)出現(xiàn)多腦區(qū)功能活動(dòng)改變，提示額葉對(duì)酒精的敏感性較高。研究[14]表明，在酒精攝入早期，盡管攝入量較低，但其對(duì)神經(jīng)認(rèn)知功能已產(chǎn)生顯著影響，而酒精長(zhǎng)期濫用可導(dǎo)致更嚴(yán)重的大腦結(jié)構(gòu)和功能損害。研究[15]表明，在狂飲和酗酒的青少年中，神經(jīng)結(jié)構(gòu)和活動(dòng)的改變可能與高塑性神經(jīng)發(fā)育期大量飲酒的神經(jīng)毒性作用有關(guān)。以上研究及本研究結(jié)果均提示慢性酒精暴露早期影響額葉腦功能；隨著酒精暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能損害；額葉為酒精成癮研究的重要的靶點(diǎn)。長(zhǎng)時(shí)間酒精暴露下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或人類額葉功能的動(dòng)態(tài)變化有待于繼續(xù)研究。

枕葉主要負(fù)責(zé)視覺(jué)處理，酒精對(duì)視覺(jué)處理中樞的影響明顯而廣泛，楔葉亦參與視覺(jué)加工。既往研究[16]表明，酒精會(huì)增加視覺(jué)網(wǎng)絡(luò)中自發(fā)BOLD信號(hào)波動(dòng)，提示酒精損害視覺(jué)刺激的正常激活響應(yīng)并影響視覺(jué)感知。慢性飲酒會(huì)影響青春期雄性恒河猴的視空間聯(lián)想記憶功能[17]。本研究結(jié)果顯示，在恒河猴酒精暴露誘導(dǎo)期后出現(xiàn)左側(cè)枕葉fALFF值減低、右側(cè)枕葉和楔葉fALFF值增加，提示視覺(jué)皮層可能是酒精誘導(dǎo)神經(jīng)活動(dòng)改變的重要靶點(diǎn)。

本研究中，恒河猴慢性酒精暴露誘導(dǎo)期后體質(zhì)量與建模前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.457)，表明動(dòng)物模型的營(yíng)養(yǎng)和能量供給均衡，模型建立過(guò)程中并未因?yàn)榫凭珨z入而導(dǎo)致能量失衡，體現(xiàn)模型的可行性，可以最大限度降低營(yíng)養(yǎng)供給失衡對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。且本研究中，MR檢查前10 min，恒河猴體內(nèi)血液酒精濃度較低，降低了急性酒精暴露對(duì)大腦的影響，從而減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。本研究的不足在于樣本量較小，數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法較單一，有待增加樣本量、改進(jìn)分析方法等進(jìn)一步研究。

綜上所述，恒河猴慢性酒精暴露誘導(dǎo)期后靜息態(tài)腦功能活動(dòng)出現(xiàn)明顯改變，表現(xiàn)為左半腦減低，右半腦增強(qiáng)，上述發(fā)現(xiàn)為后續(xù)建立非人靈長(zhǎng)類慢性酒精暴露模型提供了依據(jù)，為人類酒精成癮研究提供參考。