巫珊 李丹 劉晶晶 李俊魁 馬艷華

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，輔助生殖技術(shù)解決了不孕夫婦的生育困難問題，而成功率始終是關(guān)注的重點(diǎn)，即使有近90%的胚胎可以成功移植，但臨床妊娠率卻仍只有30%～40%[1]。有研究表明IVF-ET的平均著床率約為25%[2]，胚胎本身原因僅占1/3，而子宮內(nèi)膜接受能力導(dǎo)致植入失敗約占2/3[3]，可見胚胎移植成功除需要優(yōu)質(zhì)胚胎外，子宮內(nèi)膜的容受性也是成功與否的關(guān)鍵因素之一。因此子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)研究，對(duì)于提高妊娠率具有重大意義。本研究通過子宮內(nèi)膜微刺激觀察胞飲突變化及容受性相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，研究子宮內(nèi)膜微刺激對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月～2017年12月在我院接受IVF-ET的不孕患者120例。按患者預(yù)約降調(diào)日日期的奇偶數(shù)分組，預(yù)約降調(diào)日日期為奇數(shù)的患者納入微刺激組（共68例），預(yù)約降調(diào)日日期為偶數(shù)的患者納入非微刺激組（共52例），其中微刺激組中2例，非微刺激組1例卵子由于未完成受精從而取消周期；微刺激組3例，非微刺激組1例由于無可移植的胚胎而取消周期；微刺激組5例，非微刺激組3例由于獲得的卵母細(xì)胞數(shù)較多，為了避免OHSS而取消移植。納入本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的微刺激組有58例，非微刺激組有47例。在胚胎移植前一月經(jīng)周期的第3～5天對(duì)微刺激組進(jìn)行子宮內(nèi)膜微刺激（淺表機(jī)械性搔刮），非微刺激組則未行刺激。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者年齡24～35歲；②月經(jīng)規(guī)則，宮腔形態(tài)正常、無宮腔手術(shù)史（電切、黏連分解等），基礎(chǔ)狀態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)無輸卵管積水及卵巢囊腫；③助孕周期前3個(gè)月內(nèi)未服用促排卵藥、避孕藥或放置宮內(nèi)節(jié)育器；④不孕的原因主要為輸卵管因素、男方因素（少弱精子癥），經(jīng)子宮輸卵管造影或超聲下子宮輸卵管通液及精液常規(guī)檢查證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥、盆腔結(jié)核等；②合并高血壓性疾病，內(nèi)分泌疾病如糖尿病、甲亢、高泌乳素血癥等。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署知情同意書。

1.2 方法 月經(jīng)來潮第3～5天微刺激組患者進(jìn)行術(shù)前常規(guī)檢查，術(shù)中在不擴(kuò)宮的情況下探針探宮腔深度，最小號(hào)刮匙（內(nèi)徑寬度約2mm）輕柔搔刮宮腔內(nèi)前、后、左、右壁各一下，將內(nèi)膜組織標(biāo)本送病理檢測(cè)。當(dāng)月黃體中期微刺激組及非微刺激組所有患者進(jìn)行子宮內(nèi)膜活檢，電鏡下觀察胞飲突變化，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)子宮內(nèi)膜LIF和OPN的蛋白表達(dá)。

1.3 結(jié)局判定 胚胎移植后兩周測(cè)定血/尿HCG，如β-HCG＞20IU或尿檢陽性者為生化妊娠；胚胎移植后4～5周檢測(cè)到妊娠囊者為臨床妊娠。記錄研究參數(shù)：妊娠囊個(gè)數(shù)。統(tǒng)計(jì)研究參數(shù)：著床率=孕囊個(gè)數(shù)/移植胚胎個(gè)數(shù)，妊娠率=妊娠例數(shù)/胚胎移植例數(shù)。本研究以臨床妊娠作為妊娠的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

胞飲突的判定：含有胞飲突的子宮內(nèi)膜/整個(gè)內(nèi)膜＞50%為豐富，20%～50%為適中，＜20%為微量。

免疫組化結(jié)果的判定：實(shí)驗(yàn)需同時(shí)進(jìn)行對(duì)照染色，以增加結(jié)果的準(zhǔn)確性；抗原在特異性的位置表達(dá)即表達(dá)特異，否則為假陽性；陰性結(jié)果不可以有抗原表達(dá)；滿足以上3點(diǎn)記為陽性表達(dá)。LIF、OPN陽性結(jié)局判定：棕褐色，細(xì)顆粒狀，背景不著色，記為陽性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，釆用χ2檢驗(yàn)比較兩組間率或構(gòu)成比，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征 兩組患者的年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、不孕年限、不孕原因（男方因素、女方盆腔輸卵管因素、雙方因素）、不孕類型（原發(fā)、繼發(fā)）、FSH基礎(chǔ)值、LH基礎(chǔ)值以及FSH/LH無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.2 不孕患者COH治療情況 兩組患者Gn啟動(dòng)時(shí)竇卵泡數(shù)、使用Gn總量、使用Gn天數(shù)，以及HCG 日 E2、P比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.3 患者受精率、胚胎著床率、臨床妊娠率情況 對(duì)兩組患者獲卵數(shù)目、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、受精率、胚胎著床率、臨床妊娠率指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，微刺激組58對(duì)夫婦，共有81個(gè)周期，獲得卵母細(xì)胞數(shù)為767枚；非微刺激組47對(duì)夫婦，共有56個(gè)周期，獲得卵母細(xì)胞數(shù)為472枚。微刺激組受精率為72.0%，非微刺激組受精率為76.2%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；微刺激組胚胎著床率為38.1%、臨床妊娠率為55.2%，非微刺激組分別為24.5%和38.3%，微刺激組胚胎著床率和臨床妊娠率均高于非微刺激組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4 微刺激組與非微刺激組患者胞飲突變化 微刺激組患者的胞飲突表達(dá)較非微刺激組更為豐富，微刺激組胞飲突表達(dá)豐富為63.8%，而非微刺激組胞飲突表達(dá)豐富為36.2%，微刺激組與非微刺激組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。通過掃描電子顯微鏡觀察到子宮內(nèi)膜中檢測(cè)到胞飲突陽性表達(dá)，位于子宮內(nèi)膜的頂端上皮細(xì)胞突起，凹陷處較豐富，呈單個(gè)花蕾樣膜突起，單纖毛細(xì)胞將胞飲突分隔。

表1 微刺激組與非微刺激組患者臨床特征

表2 微刺激組與非微刺激組患者COH治療情況（±s）

表2 微刺激組與非微刺激組患者COH治療情況（±s）

項(xiàng)目 微刺激組 非微刺激組 t P例數(shù) 58 47 Gn啟動(dòng)時(shí)竇卵泡數(shù)（個(gè)） 13.72±2.97 13.73±3.51 0.0750.927 Gn總量（IU） 27.69±10.21 26.05±9.20 0.9850.325 Gn使用天數(shù) 11.65±1.58 11.33±1.52 1.1120.268 HCG日E2（pg/ml） 3258.79±1839.522912.85±1607.211.0890.264 HCG日P（mg/ml） 0.92±0.60 1.07±0.36 -1.3810.166

表3 兩組患者受精率、胚胎著床率、臨床妊娠率比較

表4 兩組患者子宮內(nèi)膜胞飲突變化比較（%）

2.5 微刺激組與非微刺激組患者LIF、OPN檢測(cè)微刺激組與非微刺激組患者的LIF、OPN免疫組化染色結(jié)果顯示，在蛋白水平LIF與OPN表達(dá)于子宮內(nèi)膜表面細(xì)胞與腺上皮細(xì)胞中，微刺激后LIF、OPN在胞質(zhì)中棕褐色染色顆粒遍布更多。微刺激組與非微刺激組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組患者子宮內(nèi)膜免疫組化檢測(cè)（×20）

3 討論

近年來隨著不孕患者越來越多，輔助生殖技術(shù)迅速發(fā)展，早期認(rèn)為胚胎著床的成功只與配子質(zhì)量、胚胎質(zhì)量有關(guān)。隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)在配子質(zhì)量和胚胎質(zhì)量提高的情況下，臨床妊娠率均無明顯變化，因此學(xué)者們將研究方向轉(zhuǎn)至子宮內(nèi)膜。研究者[4]發(fā)現(xiàn)著床失敗的不孕患者子宮內(nèi)膜容受性都存在缺陷，因此研究人員把子宮內(nèi)膜容受性也列為胚胎著床成功的關(guān)鍵因素。胚胎著床過程有嚴(yán)格的時(shí)間限制和空間限制。

本研究在進(jìn)行檢測(cè)前對(duì)微刺激組和非微刺激組患者的年齡、BMI、不孕年限、不孕原因、不孕類型、輔助方式（IVF-ET）、FSH基礎(chǔ)值、LH基礎(chǔ)值、FSH/LH等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)微刺激組與非微刺激組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明此研究方法設(shè)計(jì)合理，后續(xù)研究得到的數(shù)據(jù)結(jié)果具有代表性。檢測(cè)微刺激組與非微刺激組Gn啟動(dòng)時(shí)竇卵泡數(shù)、Gn總量、Gn使用天數(shù)、HCG日E2和P，兩組患者在控制性超促排卵治療的情況下，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明后續(xù)結(jié)果不是COH治療情況引起的不同。兩組患者獲卵數(shù)、移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、受精率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明兩組患者進(jìn)行相同的操作，證明研究的可靠性。在進(jìn)行胚胎移植前子宮內(nèi)膜微刺激組患者胚胎著床率（38.1%）、臨床妊娠率（55.2%）均高于非刺激組的24.5%和38.3%，微刺激組與非微刺激組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由此說明子宮內(nèi)膜微刺激可以提高胚胎著床率和臨床妊娠率，為提高輔助生殖患者妊娠率提供了可能。

子宮內(nèi)膜上皮有纖毛細(xì)胞和無纖毛細(xì)胞存在，開始時(shí)細(xì)胞表面由光滑而形成小的突起，之后漸漸增大，丟失微絨毛成為胞飲突[5，6]。胞飲突的作用為：可以預(yù)防纖毛的清除；促進(jìn)胚胎與子宮上皮表面的接近；具有分泌功能，且LIF在胞飲突中高水平表達(dá)[7]，是誘發(fā)子宮內(nèi)膜容受性必不可少的條件[8]。本研究結(jié)果顯示微刺激組患者的胞飲突表達(dá)較非微刺激組更為豐富，微刺激組胞飲突表達(dá)豐富為63.8%，而非微刺激組胞飲突表達(dá)豐富為36.2%，兩組胞飲突豐富程度比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。掃描電鏡檢測(cè)胞飲突在子宮內(nèi)膜中陽性表達(dá)，位于子宮內(nèi)膜的頂端上皮細(xì)胞突起，腺上皮開口處周圍的凹陷處較豐富，呈單個(gè)花蕾樣膜突起，單纖毛細(xì)胞將胞飲突分隔。由此說明，子宮內(nèi)膜微刺激可以提高胞飲突的表達(dá)，可能微刺激子宮導(dǎo)致子宮內(nèi)膜細(xì)胞釋放一些細(xì)胞因子如LIF、OPN等，引起子宮內(nèi)膜發(fā)生變化，胞飲突的變化可能是觀察到的最為直觀的現(xiàn)象，由此認(rèn)為子宮內(nèi)膜容受性也在發(fā)生變化。子宮內(nèi)膜微刺激可以提高胞飲突的表達(dá)，可間接證實(shí)提高胚胎著床率和臨床妊娠率。

白細(xì)胞抑制因子（LIF）是IL-6家族的多效分泌細(xì)胞因子，可作用于各種組織和細(xì)胞類型[9，10]。LIF在子宮內(nèi)膜腺體中表達(dá)，并作用于子宮腔上皮細(xì)胞，LIF有助于植入的粘附和侵襲階段，并且通過控制HLA-G抗原的表達(dá)參與滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲性的調(diào)節(jié)[11]。Bhatt等[12]研究發(fā)現(xiàn)LIF表達(dá)最豐富的部位是子宮內(nèi)膜腺體，特別是在妊娠第4天，同時(shí)對(duì)小鼠中的LIF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)非孕鼠子宮內(nèi)膜中不表達(dá)LIF，胚胎種植期內(nèi)膜中LIF出現(xiàn)強(qiáng)烈表達(dá)。LIF可以調(diào)節(jié)25個(gè)信號(hào)通路，其中一些信號(hào)通路已經(jīng)證實(shí)是胚胎植入必不可少的[13]。骨橋蛋白（OPN）是細(xì)胞外基質(zhì)中一種分泌性磷酸糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族成員之一，參與多個(gè)生物過程，如細(xì)胞的粘附、增殖及分化等，幾乎參與了胚胎著床的全過程[14]。Johnson等[15]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白OPN是組織營養(yǎng)因子，在胚胎的粘附和植入過程中位于子宮上皮和滋養(yǎng)層表面，OPN負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架重組，作為滋養(yǎng)層與子宮上皮之間粘附的橋梁。本研究結(jié)果顯示，微刺激組與非微刺激組患者LIF、OPN 免疫組化染色表達(dá)于子宮內(nèi)膜表面細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞，微刺激后LIF、OPN在胞質(zhì)中棕褐色染色顆粒遍布更多。由于LIF、OPN在子宮內(nèi)膜的移植期表達(dá)下降，使胚胎的識(shí)別、粘附和移植過程受損，影響了胚胎著床，是導(dǎo)致不孕患者妊娠率低和流產(chǎn)率高的重要原因之一。LIF、OPN都是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性細(xì)胞因子，微刺激后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)因子都有明顯提高，OPN的提高不明顯，但與非微刺激組相比也有所提高，LIF的提高較明顯，也可以證實(shí)LIF是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性因子。微刺激提高子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志性細(xì)胞因子LIF、OPN蛋白水平的表達(dá)，是子宮內(nèi)膜容受性提高的直接證據(jù)。

綜上所述，通過對(duì)子宮內(nèi)膜進(jìn)行微刺激，內(nèi)膜自我損傷修復(fù)改善了內(nèi)膜容受性，提高了胚胎著床率及臨床妊娠率。但微刺激程度、患者微刺激時(shí)間等具體的最佳標(biāo)準(zhǔn)仍不確定，需要進(jìn)一步探索。同時(shí)子宮內(nèi)膜微刺激的作用機(jī)制目前無明確定論，無法為提高子宮內(nèi)膜容受性提供理論支持，需要進(jìn)一步的研究，以改善胚胎著床率和臨床妊娠率。