李曉娟，史穎，楊筱鳳

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科二區(qū)，陜西 西安 712000;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710061)

宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)由量變到質(zhì)變的累積過程，歷經(jīng)了宮頸炎-宮頸上皮內(nèi)瘤變(CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ)-宮頸癌的遞進(jìn)式病變，持續(xù)性的高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是發(fā)展至宮頸癌的先決條件[1]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示這個(gè)過程具有可逆性，CINⅠ的自然消退率達(dá)到90%以上，CINⅡ約為45%～65%，CIN Ⅲ只有25%～35%，發(fā)展至宮頸癌中晚期，患者的5年生存率僅有10%左右[2]。因此，將疾病控制在早期階段是增加治愈率、延長患者生存期的一個(gè)重要方向。在抗腫瘤治療中，免疫機(jī)制受到越來越多的重視，免疫系統(tǒng)是人體內(nèi)自然存在的抗腫瘤機(jī)制，近幾年較受重視的是CD4+T細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞也稱輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)，其中Th1/Th2、Th17/CD4+CD25+Treg兩大平衡體系在病原體與腫瘤免疫中均起了重要作用。當(dāng)前研究已證實(shí)[3-4]，Th17/CD4+CD25+Treg平衡與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞均參與了宮頸癌的病理機(jī)制，本研究觀察吉西他濱對(duì)宮頸癌患者外周血腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞及Th17/CD4+CD25+Treg的影響，為完善其藥理機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 資料與方法

1.1一般資料研究對(duì)象為陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院2014年12月至2016年12月收治的59例宮頸癌患者，年齡(48.5±13.4)歲，年齡范圍為37～63歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)首次確診為宮頸癌，且有確切的組織學(xué)診斷依據(jù)證實(shí)為宮頸癌國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期Ⅰb2～Ⅱb期；(2)擬行根治術(shù)治療；(3)人乳頭瘤病毒(HPV)陽性；(4)美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評(píng)分0～2分。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期與哺乳期；(2)既往有放化療治療史；(3)近3個(gè)月有激素或免疫治療史；(4)合并有傳染性疾病或其他感染性疾病；(5)糖尿病；(6)免疫系統(tǒng)合并癥等。本研究經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均自愿簽署知情同意書。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為觀察組(30例)和對(duì)照1組(29例)，一般資料比較如表1所示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。另取11例同期入院體檢者作為外周血對(duì)照(對(duì)照2組)，年齡(48.3±10.1)歲，年齡范圍為38～60歲。

表1 兩組一般資料的比較

1.2治療方法兩組患者均先給予三維適形放療，患者仰臥位，先以CT掃描確立放療范圍，自第三腰椎上緣掃描至陰道外口下5 cm，基本可確定腫瘤位置與體積，并勾畫出計(jì)劃靶體積(PTV)。采用6 m V-X射線照射，按照7野照射方式(即0°、52°、104°、156°、204°、256°、308°七個(gè)角度)照射。單次劑量1.8～2.0 Gy，每周5次，總劑量55～65 Gy。觀察組在三維適形放療的基礎(chǔ)上再給予注射用鹽酸吉西他濱(齊魯制藥，批號(hào)AAED8009A)新輔助化療，用量為800 mg·m-2，第1天和第8天給藥，予三維適形放療同時(shí)進(jìn)行。三維適形放療和新輔助化療之后，所有患者行廣泛性子宮切除加盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。

1.3方法

1.3.1流式細(xì)胞法測定Th17與CD4+CD25+Treg的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù) 對(duì)照2組患者于入院體檢時(shí)，宮頸癌患者于治療前1 d、治療后1周采用流式細(xì)胞儀測定外周血單個(gè)核細(xì)胞Th17與CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例。主要步驟：(1)受試者者均于清晨8：00點(diǎn)取空腹肘靜脈血2～3 mL，肝素抗凝，取血器和離心管均以肝素潤洗。加入等體積Hank’s液，充分混勻，再加入適量淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r·min-1低速離心18 min，離心半徑為6 cm；(2)離心后管中液體分為三層，自上而下分別為血漿、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的混合體，在血漿和淋巴細(xì)胞之間有一層白色的云霧帶，為單個(gè)核細(xì)胞富集區(qū)；(3)以毛細(xì)管吸取單個(gè)核細(xì)胞，采用5倍體積Hank’s液重懸與洗滌、1 500 r·min-1低速離心10 min，離心半徑6 cm，重復(fù)1次；(4)所得單個(gè)核細(xì)胞制成1×106個(gè)/100 μL的混懸液，先后以佛波酯與離子霉素刺激，上機(jī)檢測;(5)流式細(xì)胞儀購自德國貝克曼庫爾特公司，型號(hào)CytoFLEX，Th17細(xì)胞以CD4-FITC抗體與IL-17-PE抗體標(biāo)記；CD4+CD25+Treg細(xì)胞以CD4-FITC抗體、CD25-APC抗體及Foxp3-PE抗體標(biāo)記。

1.3.2酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測定Th17與CD4+CD25+Treg細(xì)胞因子的血清水平 于治療前1 d、治療后1周采用ELISA實(shí)驗(yàn)測定相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-17A(IL-17A)、白細(xì)胞介素-17F(IL-17F)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)水平。主要步驟：(1)受試者者均于清晨8：00點(diǎn)取空腹肘靜脈血2～3 mL，不抗凝，常溫靜置1 h，4 000 r·min-1離心10 min獲得血清，離心半徑6 cm；(2)采用全自動(dòng)生化分析儀(德國貝克曼庫爾特AU5800)和ELISA試劑盒測定IL-17A、IL-17F、IL-10、TGF-β1水平的血清水平，本次使用的試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.3.3免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測定腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá) 術(shù)中留取病理組織以及周邊健康組織(距離病理組織2 cm以上)，采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)法測定腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)。主要步驟：(1)制備石蠟病理切片。術(shù)中留取的組織切成1 cm3小塊浸泡于4.0%多聚甲醛溶液，制備石蠟病理切片，厚度5～7 μm。(2)脫蠟至水。二甲苯脫蠟，3 min×2次，梯度乙醇脫苯至水，3% H2O2處理10 min阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性。(3)抗原熱修復(fù)。載玻片置于載玻片架，載玻片架置于大燒杯，大燒杯倒?jié)M枸櫞酸緩沖液，微波爐中高火10～15 min，自然冷卻至室溫，連續(xù)2次。(4)抗體孵育。滴加一抗(Abcam，批號(hào)GR140316-2)，濃度為1∶200，4 ℃孵育過夜；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液清洗，5 min×3次，滴加二抗(Abcam，批號(hào)GR140221-1)，37 ℃孵育60 min，濃度為1∶1 000。(5)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，反藍(lán)后中性樹膠封片，鏡下觀察。染成黃色或棕黃色者為陽性，Image-Pro Plus分析陽性強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1Th17與CD4+CD25+Treg的外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)治療前，對(duì)照1組和觀察組患者的Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)均低于對(duì)照2組，CD4+CD25+Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于對(duì)照2組，且對(duì)照1組和觀察組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，對(duì)照1組和觀察組的Th17細(xì)胞有所增多，CD4+CD25+Treg細(xì)胞有所減少，Th17/CD4+CD25+Treg增大，且觀察組變化幅度高于對(duì)照1組，兩組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和圖2。

2.2Th17與CD4+CD25+Treg細(xì)胞因子的血清水平治療前，對(duì)照1組和觀察組患者的血清IL-17A、IL-17F、IL-10及TGF-β1比較均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，對(duì)照1組和觀察組IL-17A與IL-17F水平有所升高，IL-10與TGF-β1水平有所降低，且觀察組變化幅度大于對(duì)照1組，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.3腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)兩組病灶組織的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)量均高于健康組織，兩組健康組織的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組病灶組織腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)量高于對(duì)照1組，組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

隨著我國老齡化趨勢的加劇以及普查力度的加強(qiáng)，宮頸癌的檢出率越來越高，且呈現(xiàn)出一定程度的年輕化趨勢。吉西他濱是一種人工合成的新型的胞嘧啶核苷衍生物，1996年正式批準(zhǔn)上市，對(duì)大多數(shù)實(shí)體瘤有確切效果，是晚期胰腺癌的一線治療藥物，宮頸癌的二線治療藥物。其主要作用機(jī)制是進(jìn)入人體后，經(jīng)酶催化轉(zhuǎn)化為活性代謝物二磷酸核苷和三磷酸核苷，兩者可抑制核糖核苷酸還原酶，從而抑制DNA 合成[5]。此外，臨床實(shí)踐證實(shí)吉西他濱還是一種放射增敏劑，與放射療法合用可起到協(xié)同作用，增強(qiáng)抑瘤效果[6]。在宮頸癌的病理機(jī)制中，Th17/CD4+CD25+Treg平衡與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞發(fā)揮了重要作用，本研究觀察了吉西他濱對(duì)宮頸癌Th17/CD4+CD25+Treg平衡與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的影響，以完善其藥理機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

注：A為對(duì)照2組；B為對(duì)照1組治療前；C為觀察組治療前；D為對(duì)照1組治療后；E為觀察組治療后；F為柱狀統(tǒng)計(jì)圖，與對(duì)照2組治療前相比，aP<0.05，與觀察組治療后相比，bP<0.05,與同組治療前相比，cP<0.05圖1 三組患者治療前后外周血Th17細(xì)胞比例的比較

注：A為對(duì)照2組；B為對(duì)照1組治療前；C為觀察組治療前；D為對(duì)照1組治療后；E為觀察組治療后；F為柱狀統(tǒng)計(jì)圖，與對(duì)照2組治療前相比，aP<0.05,與觀察組治療后相比，bP<0.05，與同組治療前相比，cP<0.05圖2 三組患者治療前后外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例比較

注： A為IL-17A；B.IL-17F；C為IL-10；D為TGF-β1；與對(duì)照2組治療前相比，aP<0.05；與觀察組治療后相比，bP<0.05；與同組治療前相比，cP<0.05圖3 三組患者治療前后Th17與CD4+CD25+Treg細(xì)胞因子的血清水平比較

研究結(jié)果顯示，就Th17/CD4+CD25+Treg平衡而言，治療前觀察組和對(duì)照1組患者的Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+CD25+Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)及Th17/CD4+CD25+Treg均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，兩組Th17細(xì)胞增多，CD4+CD25+Treg細(xì)胞減少，Th17/CD4+CD25+Treg增大，且觀察組變化幅度大于對(duì)照1組。Th17/CD4+CD25+Treg平衡體系和Th1/Th2平衡體系是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞最主要的兩大體系[7]，在腫瘤生長和HPV感染的過程中，Th17細(xì)胞主要起免疫激動(dòng)作用，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫發(fā)揮活性，清除HPV和殺死腫瘤細(xì)胞[8]。而CD4+CD25+Treg細(xì)胞則主要起免疫抑制作用，其生理功能在于防止免疫反應(yīng)過激造成的自體性損傷[9]。有研究證實(shí)[10]，腫瘤細(xì)胞也能產(chǎn)生TGF-β1，誘導(dǎo)生成大量CD4+CD25+Treg細(xì)胞，從而削弱細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)腫瘤的識(shí)別與清除能力，這也是腫瘤免疫逃逸的重要機(jī)制之一。因此，可以說Th17/CD4+CD25+Treg升高意味著機(jī)體對(duì)腫瘤清除能力的增強(qiáng)，反之，意味著機(jī)體對(duì)腫瘤清除能力的衰退。既往已有研究證實(shí)，宮頸癌患者存在Th17/CD4+CD25+Treg漂移現(xiàn)象，Th17細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，細(xì)胞因子受到抑制，與此同時(shí)CD4+CD25+Treg細(xì)胞增多，細(xì)胞因子大量分泌。Th17細(xì)胞的主要細(xì)胞因子為IL-17，含A～F六種亞型，血清學(xué)研究一般考察IL-17A與IL-17F，因兩者均為水溶性，血清含量豐富[11]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞無特異性的細(xì)胞因子，可大量分泌TGF-β1與IL-10，且CD4+CD25+Treg細(xì)胞的形成也需要這兩者的誘導(dǎo)[12]，因此本研究在考察Th17/CD4+CD25+Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)比的同時(shí)，也考察了IL-17A、IL-17F、IL-10及TGF-β1。結(jié)果顯示，治療前兩組患者的血清細(xì)胞因子水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后，兩組IL-17A與IL-17F水平有所升高，IL-10與TGF-β1水平有所降低，且觀察組變化幅度高于對(duì)照1組。該結(jié)果從細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞因子兩個(gè)方面證實(shí)了吉西他濱對(duì)緩解Th17/CD4+CD25+Treg漂移有積極作用。

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)中數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞群，大約占炎癥細(xì)胞總數(shù)的30%～50%[13]。研究指出[14]，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能通過加快淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與血行轉(zhuǎn)移促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的散播和擴(kuò)展。也有研究指出[15]，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠分為極化為M1型和M2型，參與腫瘤免疫炎癥的調(diào)控，類似于Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。鑒定腫瘤組織中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞多采用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)測定CD68的表達(dá)水平，雖然CD68也表達(dá)于脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其他細(xì)胞，但因?yàn)榫奘杉?xì)胞缺乏特異性的譜系標(biāo)志，目前尚無更好的方案。本研究采用傳統(tǒng)方案，以CD68表達(dá)水平衡量腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示兩組病灶組織的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)量均高于健康組織，且觀察組病灶組織表達(dá)量高于對(duì)照1組病灶組織。既往也有學(xué)者[16]指出，腫瘤組織與周邊正常組織之間的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)存在明顯的“梯度差”，與本研究結(jié)果一致。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞多來源于外周循環(huán)血中的單核細(xì)胞，受腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)，向病灶處遷移并分化為巨噬細(xì)胞，從而為病灶增殖做準(zhǔn)備。本研究結(jié)果一方面證實(shí)了“梯度差”的存在事實(shí)，另一方面也說明吉西他濱對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

綜上所述，吉西他濱能夠抑制宮頸癌患者Th17/CD4+CD25+Treg漂移和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞活性，可能是其發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一。本研究的主要局限性在于未行靶向干預(yù)實(shí)驗(yàn)，明確Th17/CD4+CD25+Treg和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之間是否存在相關(guān)性，因此，本研究僅能明確吉西他濱能作用于兩者，但其確切機(jī)制尚需更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)深入探討。