張成，許東偉，高澤立

(1.上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院，a消化內(nèi)科，b重癥監(jiān)護(hù)室，上海 201318；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 201200)

急性胰腺炎是臨床常見的疾病，其發(fā)病率為(4.8～24.0)/10萬。約20%的患者會發(fā)展為重癥急性胰腺炎(SAP)，急性胰腺炎病死率在5%～10%左右，其中死亡者大多為SAP患者，因此SAP的診斷和預(yù)后指標(biāo)受到臨床工作者的廣泛重視。盡管目前對急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的了解尚不完整，但是胰腺內(nèi)酶原粒內(nèi)儲存的特定胰蛋白酶原過早激活在急性胰腺炎發(fā)病中起到了舉足輕重的作用[1]。因此，腺泡細(xì)胞損傷造成的酶原分泌急性受損及酶源粒基底成分釋放標(biāo)志著急性胰腺炎的開始[2]，而隨之發(fā)生的急性炎癥將會引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重者甚至可能導(dǎo)致休克。因此，腺泡細(xì)胞相關(guān)分子的滲出及炎癥細(xì)胞因子的釋放共同形成了一個(gè)潛在的急性胰腺炎特異性分子標(biāo)志物。盡管新的血清標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，血清脂肪酶分析已成為診斷急性胰腺炎的重要血清學(xué)證據(jù)。然而，脂肪酶分析并不能對急性胰腺炎嚴(yán)重程度定義。目前，C-反應(yīng)蛋白和原降鈣素常用于判斷急性胰腺炎嚴(yán)重程度的分子標(biāo)志物。

糖蛋白-2(GP-2)是表達(dá)在胰腺外分泌酶原顆粒上的主要膜蛋白[3]。在經(jīng)典急性胰腺炎動物模型中發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎動物模型的GP-2顯著上升[4]。GP-2有GP-2α和GP-2β兩個(gè)亞型，兩種亞型表達(dá)量基本一致。在外分泌胰腺的刺激下，GP-2的兩種亞型均可釋放進(jìn)入胰管[5]。以往研究顯示，急性胰腺炎患者血清GP-2水平遠(yuǎn)高于正常對照組[6]。與已有的脂肪酶/淀粉酶檢測相比，GP-2診斷急性胰腺炎的準(zhǔn)確度更高。然而，在慢性胰腺炎和胰腺癌中，GP-2水平同樣有升高趨勢[7]，因此在臨床應(yīng)用于急性胰腺炎的診斷受到局限。本文通過研究SAP患者血清中的GP-2α水平變化，考察血清GP-2α水平對于SAP的診斷及預(yù)后中的評估價(jià)值，以期找到特異性更強(qiáng)的SAP診斷標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2012年6月至2016年6月上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院消化內(nèi)科入院治療的急性胰腺炎患者88例，其中SAP患者48例，輕癥急性胰腺炎(MAP)患者40例。SAP組中有6例患者入院后死亡，其中1例患者于入院第3天死亡，2例患者于入院第4天死亡，3例患者于入院第8～14天內(nèi)死亡。SAP和MAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)均符合2003年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會胰腺病學(xué)組制定的中國急性胰腺炎診治指南[8]。兩組患者的一般資料見表1，年齡、性別、發(fā)病時(shí)間等一般資料比較，差異無統(tǒng)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料的比較

1.2研究方法入選患者分別在入院第1、3、5、7、14天于清晨空腹抽取靜脈血5 mL，血樣不抗凝，血樣采集后2 h內(nèi)，進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為2 000～3 000 r·min-1，離心5 min，取上清，并于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清中GP-2α和GP-2的含量。

首先使用GP-2α多克隆抗體包被96孔板過夜。然后將已知濃度的GP-2α標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。之后將空白對照液、倍比稀釋后的GP-2α標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測血清分別加入有GP-2α抗體包被的96孔板中(每孔50 μL)，室溫孵育1～2 h，使用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗3次后，甩凈緩沖液，加入酶標(biāo)二抗，室溫孵育30 min。加入終止液后混勻。于30 min內(nèi)讀取480 mm處吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度繪制GP-2α的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清中GP-2α濃度。采用同樣的方法和步驟檢測患者血清中GP-2含量。根據(jù)前期方法摸索試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)患者血清中的GP-2α/GP-2濃度高于0.1 U時(shí)，即可被檢出。實(shí)驗(yàn)所需GP-2α多克隆抗體、GP-2多克隆抗體/酶標(biāo)二抗均從SANTA CRUZ公司購買。

2 結(jié)果

2.1三組血清GP-2α測定結(jié)果比較研究選取的48例SAP患者中42例患者治愈并出院，死亡6例(死亡組)，病死率為12.5%。各組血清GP-2α水平見表2。采用兩因素重復(fù)測量方差分析對三組患者血清GP-2α水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)交互作用顯著(F=91.36，P<0.01)。再對每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的不同組別患者GP-2α水平進(jìn)行多變量方差分析。兩兩比較血清GP-2α顯示：入院第1天死亡組顯著高于MAP組和SAP組(P<0.01)，SAP組與MAP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.186)。入院第3天和第5天死亡組和SAP組顯著高于MAP組(P<0.01)，同時(shí)死亡組顯著高于SAP組(P<0.05)。入院第7天，由于死亡組患者例數(shù)過少，不納入統(tǒng)計(jì)，SAP組顯著高于MAP組(P<0.01)。第14天，死亡組無病例，SAP組與MAP組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SAP組顯著高于MAP組(P<0.01)。

表2 三組血清GP-2α測定結(jié)果

注：“—”表示此項(xiàng)無數(shù)據(jù)

2.2GP-2α與GP-2水平診斷價(jià)值比較分別對入院第3天的患者GP-2α水平和GP-2水平進(jìn)行ROC回歸曲線分析，結(jié)果見圖1。GP-2α預(yù)測SAP的AUC為0.938，GP-2預(yù)測SAP的AUC為0.762，兩者對于SAP均具有一定預(yù)測價(jià)值，但GP-2α的特異性更高。

圖1 GP-2α與GP-2水平診斷SAP的ROC曲線

2.3不同臨床類型急性胰腺炎患者血清GP-2α水平比較此外，本研究還對不同類型SAP患者血清GP-2α水平(表3)進(jìn)行了單因素重復(fù)測量方差比較，結(jié)果顯示，急性胰腺炎患者血清GP-2α水平在不同時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.98，P<0.05)，但急性胰腺炎類型與入院天數(shù)之間無交互作用(F=2.37，P=0.06)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行的單因素方差分析顯示，在同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，不同類型急性胰腺炎患者血清GP-2α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

SAP是一種常見的消化道疾病，是一種多因素引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征。一旦發(fā)展到重癥，往往出現(xiàn)胰腺壞死和多器官功能衰竭等，治療相當(dāng)困難。如何能在急性胰腺炎發(fā)作的早期盡快判定病情輕重度，及時(shí)給予有效的干預(yù)與治療，有助于降低患者病死率，對臨床工作非常重要。

血清淀粉酶是目前診斷急性胰腺炎常用指標(biāo)，在一定程度上對急性胰腺炎的診斷有著不可替代的地位[9]，但淀粉酶的高低不一定反映病情輕重，且其水平變化通常不超過1 周，對預(yù)后的評估價(jià)值較弱。近期研究發(fā)現(xiàn)，GP-2可能是急性胰腺炎的重要分子標(biāo)志物[10]。GP-2與消化酶原共同分泌至小腸中，隨后起到抗菌、免疫調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)腺泡內(nèi)吞的作用。胰腺自溶是引起急性胰腺炎病理反應(yīng)的重要機(jī)制之一，將會引起包括GP-2在內(nèi)的胰腺內(nèi)酶源粒成分大量釋放。

GP-2α是GP-2的亞型之一，通過羰基-磷脂酰肌醇錨定在膜表面，一旦胰腺分泌受到刺激，GP-2α就會轉(zhuǎn)運(yùn)到腺細(xì)胞的頂端質(zhì)膜上，從而分泌到胰導(dǎo)管。當(dāng)胰腺出現(xiàn)炎癥或破壞時(shí)，GP-2α則可以釋放入血清中，導(dǎo)致血清濃度升高[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)典的大鼠急性腎盂腎炎模型中，GP-2在模型誘導(dǎo)后的第24小時(shí)仍處于高水平，而淀粉酶水平卻已經(jīng)恢復(fù)[4]。臨床實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，GP-2的敏感性顯著高于淀粉酶和脂肪酶[6]。此外，臨床研究還發(fā)現(xiàn)，在急性胰腺炎患者中，入院后第6天GP-2α仍處于高水平狀態(tài)[11]，但GP-2在MAP、胰腺癌的患者中也會有一定程度升高，因此尋找特異性較高的標(biāo)志物十分重要。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在入院后第3、5、7、14天，SAP患者的血清GP-2α水平均顯著高于MAP患者。在愈的SAP組患者入院后血清GP-2水平逐漸升高，于第3～5天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，在第14天仍顯著高于MAP組患者。對于死亡的SAP患者，GP-2α升高后不再降低。更重要的是，與最新文獻(xiàn)報(bào)道相同[12]，GP-2α的預(yù)測價(jià)值高于GP-2，具有更高特異性。

表3 不同類型急性胰腺炎患者血清GP-2α水平

綜上所述，GP-2α在SAP診斷方面特異性高，維持時(shí)間較長，對疾病的預(yù)后有一定的判斷價(jià)值，因此是一項(xiàng)很有潛力的診斷指標(biāo)。