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        健脾解毒方對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及基因調(diào)控機(jī)制的研究

        2018-11-05 09:06:26魏征李亞峰梁瑞峰張俊萍
        新中醫(yī) 2018年11期
        關(guān)鍵詞:膜電位離心管健脾

        魏征,李亞峰,梁瑞峰,張俊萍

        河南省中醫(yī)藥研究院,河南 鄭州 450004

        流行病學(xué)調(diào)查研究表明我國(guó)胃癌患者發(fā)病及死亡人數(shù)已占全球胃癌病患總?cè)藬?shù)的50%,其發(fā)病率和死亡率分別位于我國(guó)惡性腫瘤疾病的第二位和第三位[1],我國(guó)每年新發(fā)病例約40萬例,占世界總發(fā)病例數(shù)的42%。據(jù)報(bào)道,至2015年胃癌成為中國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率首位的惡性腫瘤[2]。因此,探討胃癌凋亡機(jī)理,尋找治療胃癌有效途徑是目前胃癌研究的一項(xiàng)重要課題。中藥治療腫瘤有療效確切、副作用少等無可比擬的優(yōu)勢(shì)[3]。中醫(yī)治療胃癌也由單純臨床報(bào)道進(jìn)入了較為系統(tǒng)的臨床與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的前瞻性研究,并且開始從分子機(jī)制揭示中藥治療胃癌的機(jī)制。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展,國(guó)內(nèi)外在腫瘤凋亡研究上取得了較大進(jìn)展,凋亡受抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的病理現(xiàn)象,與腫瘤的治療密切相關(guān)[4~5]。因此,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是設(shè)計(jì)治療方案的重要思路。然而健脾解毒中藥能否參與凋亡相關(guān)線粒體通路與死亡受體通路這一科學(xué)問題仍未解決,因此這也是本課題將要探索的方向。

        1 材料與方法

        1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫。

        1.2 試劑和儀器 健脾解毒方,藥物組成:黨參15 g,白術(shù)、半枝蓮、八月札各10 g,當(dāng)歸8 g,薏苡仁12 g,甘草5 g,生黃芪36 g。由河南省中醫(yī)藥研究院自制為片劑,用研缽搗成粉末,用DMSO配置濃度為100 mg/mL的母液備用。Thermo CO2培養(yǎng)箱;熒光定量PCR儀Roto-gene 6000(Corbett Research),PCR 擴(kuò)增儀 2720 Thermal Cycler(Appiled Biosystem);3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,美國(guó)Sigma公司);DMEM培養(yǎng)基(杭州四季青公司);B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞色素C(Cytochrome c)、自殺相關(guān)因子(Factor associated suicide,F(xiàn)as)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)兔抗鼠抗體(Santacruze公司);總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 Takara公司);Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8引物(上海生工生物工程有限公司);化學(xué)發(fā)光試劑盒、化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon公司)。

        1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 96孔板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞,接種濃度是5×104個(gè)/mL,以10、20、40μg/mL健脾解毒方分別作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h,加入MTT(1 mg/mL),37℃,4 h,加入100μL DMSO,酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度。相對(duì)抑制率(%)=(1-給藥組吸光值/對(duì)照組吸光值)×100%。

        1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞,24 h后加入健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL),加藥24 h后,收集細(xì)胞,AnnexinⅤ/PI染色,室溫下30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

        1.5 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位 酶標(biāo)儀檢測(cè)方法:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù),按每孔5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100μL,培養(yǎng)24 h后,以10、20、40μg/mL的健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h,用PBS清洗細(xì)胞2次,5μg/mL JC-1染料37℃孵育細(xì)胞30 min。然后用PBS清洗細(xì)胞2次,用熒光酶標(biāo)儀定量分析。JC-1染料的激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射光波長(zhǎng)為535 nm和595 nm。

        1.6 qRT-PCR檢測(cè)SGC-7901中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA的表達(dá) 用6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞,24 h后加入健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL),加藥24 h后,吸掉培養(yǎng)基,PBS洗3次,加入500μL/孔的Trizol,搖晃均勻,靜置5 min后反復(fù)吹打,收集細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中加入Trizol反復(fù)抽吸均勻,離心管中加入Trizol總體積的1/5量的氯仿,振蕩混勻30 s,室溫下靜置5 min,4℃條件下12 000×g離心15 min,分相為三層,上層清液為RNA(約為Trizol的60%)。小心吸取上清液,轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL離心管中,有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避免觸及,上清液加入與上清液等體積的異丙醇,上下顛倒混勻30 s。4℃靜置30 min,4℃條件下14 000×g離心15 min,RNA沉淀將在離心管底部形成。小心棄去上清液,離心管加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇-25%DEPC-H2O振蕩混勻30 s,使沉淀振蕩起來,4℃條件下16 000×g離心15 min。小心棄去上清液,防止RNA沉淀丟失,倒置離心管于濾紙上,干燥RNA,但不能完全干燥(10~20 min)。用DEPC水10μL溶解沉淀,反復(fù)吹打使其溶解。(注:RNA干燥后呈無色透明片狀,用水溶解后注意仔細(xì)淋洗離心管底部),測(cè)量OD值后,樣品放置-70℃保存,保質(zhì)期一個(gè)月用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表1)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:Bax、Cytochromec、Fas、Caspase 8 95℃,預(yù)變性 5 min;95℃,變性 10 s;60℃,退火 30 s,72℃,延伸30 s,重復(fù)40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法,分析目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

        表1 檢測(cè)引物序列

        1.7 Western-blot檢測(cè)Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 蛋白表達(dá) 6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞,用健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL)處理SGC-7901細(xì)胞 24 h,收集細(xì)胞,離心5 min,PBS洗3次,每毫升加入100μL的細(xì)胞裂解液,置冰上裂解20 min,12 000×g離心6 min,取上清液,取等量總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后,將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVNF膜上,封閉液封閉1 h后,加入1抗于室溫2 h后,用TBST洗滌3次,加入2抗溫育1 h,最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色,發(fā)光成像儀記錄結(jié)果。

        1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件,單因素方差分析(one-way ANOVA),計(jì)量資料以(±s)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同濃度健脾解毒方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用見表2,圖1。與對(duì)照組比較,20、40μg/mL健脾解毒方細(xì)胞抑制率較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且呈劑量依賴性。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況,與對(duì)照組比較,10 μg/mL的健脾解毒方處理24 h后,SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)未有明顯改變;20μg/mL的健脾解毒方處理24 h后,SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,細(xì)胞變圓;40μg/mL的健脾解毒方處理后的細(xì)胞皺縮,數(shù)目明顯減少。

        表2 不同濃度健脾解毒方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s)

        表2 不同濃度健脾解毒方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s)

        與對(duì)照組比較,①P<0.05

        組 別對(duì)照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3抑制率(%)-2 0.9 2±1.4 2 5 1.6 5±0.5 2①6 7.7 5±1.0 2①

        圖1 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901細(xì)胞24 h形態(tài)的改變(×100)

        2.2 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 見表3,圖2。10、20、40μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞后,分別有5.98%、14.94%和31.88%細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。與對(duì)照組比較,10、20、40μg/mL健脾解毒方組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05),并呈濃度依賴性,表明健脾解毒方能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。

        表3 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(±s)

        表3 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(±s)

        與對(duì)照組比較,①P<0.05

        組 別對(duì)照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3細(xì)胞凋亡率(%)2.5 2±0.6 2 5.9 8±1.0 9①1 4.9 4±0.6 2①3 1.8 8±0.3 1①

        圖2 細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

        2.3 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對(duì)線粒體膜電位的影響見表4,圖3。隨著健脾解毒方濃度的增加,SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位呈濃度依賴性下降(P<0.05)。熒光酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果顯示,不同濃度健脾解毒方給藥處理24 h后能夠降低細(xì)胞線粒體紅綠熒光比值。與對(duì)照組比較,不同濃度健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后,細(xì)胞中JC-1單體形式逐漸增多,說明了線粒體膜電位下降,在40μg/mL健脾解毒方處理時(shí)線粒體膜電位下降最明顯。

        表4 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對(duì)線粒體膜電位的影響(±s) %

        表4 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對(duì)線粒體膜電位的影響(±s) %

        與對(duì)照組比較,①P<0.05

        組別對(duì)照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 J C-1單體(r e d/g r e e n)1 0 0 9 7.7 2±0.5 9 7 9.6 4±0.5 5①4 5.1 2±1.0 1①

        圖3 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對(duì)線粒體膜電位的影響 (×400)

        2.4 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響 見表5。與對(duì)照組比較,10、20、40μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后,SGC-7901細(xì)胞中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的基因表達(dá)明顯升高(P<0.05,P<0.01),并呈劑量依賴性。

        表5 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響(±s)

        表5 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響(±s)

        與對(duì)照組比較,①P<0.05,②P<0.01

        組 別對(duì)照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.4 7±0.1 3①1.6 6±0.3 2①3.2 5±0.4 8②C y t o c h r o m e c 1 1.2 3±0.6 2①2.3 7±0.5 7①3.1 6±0.3 9②F a s 1 1.1 8±0.3 7①1.9 2±0.5 8①2.7 8±0.3 3②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6①2.3 6±0.5 1①3.3 8±0.1 9②

        2.5 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響 見表6,圖4。20、40 μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后,隨著藥物濃度的增加,Bax、Cytochromec、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)含量也增加(P<0.05,P<0.01),且呈濃度依賴性。說明該藥物通過增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的蛋白表達(dá),來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

        表6 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

        表6 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

        與對(duì)照組比較,①P<0.05,②P<0.01

        組 別對(duì)照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.1 8±0.2 1①1.6 9±0.4 2①2.4 1±0.5 5②C y t o c h r o m e c 1 1.3 4±0.7 6①2.7 3±0.6 6①4.5 7±0.5 3②F a s 1 1.3 8±0.4 1①2.6 2±0.4 9①3.8 2±0.5 8②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6 1.3 7±0.4 2①1.6 3±0.2 6①

        圖4 不同濃度健脾解毒方對(duì)SGC-7901細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

        3 討論

        目前對(duì)于胃癌不適于手術(shù)或放化療治療的患者,采用保守治療,無論中藥還是西藥,其作用機(jī)制的研究都已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展,總結(jié)起來主要有以下幾個(gè)方面:直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[6];調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[7];誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化[8];調(diào)控胃癌基因的表達(dá)[9];活化腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路[10]。其中關(guān)于細(xì)胞凋亡與線粒體通路、死亡受體信號(hào)通路的研究是目前的研究熱點(diǎn),眾多治療胃癌的有效中藥的作用機(jī)制也與以上兩方面有密切關(guān)系[11~13]。由此可見,線粒體通路、死亡受體信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡,在胃癌的治療上有舉足輕重的地位。

        細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡,是由機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號(hào)觸發(fā),在基因調(diào)控下引起細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程,既是生物體維持自身穩(wěn)定和平衡的一個(gè)重要機(jī)制,也是消除異常增殖細(xì)胞的理想途徑,該途徑紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育異常和加速腫瘤的發(fā)生和惡化[14]。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡信號(hào)通路包括2條:(1)線粒體信號(hào)通路:許多凋亡信號(hào)通過進(jìn)入線粒體,誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的Cytochrome c等小分子釋放到胞漿,活化Caspase-9,活化的Caspase-9切割pro-caspase-3生成Caspase-3,從而誘導(dǎo)凋亡[15];(2)死亡受體信號(hào)通路:一些凋亡刺激因素激活細(xì)胞膜外死亡受體,死亡受體進(jìn)一步活化膜上Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域,結(jié)合并活化半活化Caspase-8,活化的Caspase-8進(jìn)一步切割pro-caspase-3生成Caspase-3,從而誘導(dǎo)凋亡[16]。在細(xì)胞凋亡通路中,線粒體扮演著重要角色,表現(xiàn)在:(1)釋放Caspases激活因子如Cytochrome c[17];(2)喪失電子傳遞鏈功能,ATP生成減少,細(xì)胞能量不平衡[18];(3)線粒體膜電位消失,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[19];(4)承載Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17]。其中線粒體釋放Cytochrome-c,是Caspases自身正反饋激活鏈中關(guān)鍵步驟。Fas是該死亡區(qū)域的重要受體之一,F(xiàn)asL是同源三聚體分子,活化后通過“死亡結(jié)構(gòu)域”與接頭分子Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-assoeiated death domain,F(xiàn)ADD)結(jié)合而引起FADD構(gòu)象變化,進(jìn)而募集Caspase-8、Caspase-10形成復(fù)合物 DISC(death-inducing signaling complex)引 起 Caspase-8、Caspase-10自身剪切激活,啟動(dòng)下游Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),激活Caspase-6、Caspase-3、Caspase-7引發(fā)了細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)健脾解毒方能夠通過增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

        實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:健脾解毒方在40μg/mL濃度能夠有效的降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位,影響線粒體正常功能,并通過增加Cytochrome c的釋放、刺激Fas蛋白的表達(dá)、激活Caspase-8的表達(dá),促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,顯示健脾解毒方可能通過線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑來發(fā)揮抗腫瘤的作用。

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