魏征，李亞峰，梁瑞峰，張俊萍

河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004

流行病學(xué)調(diào)查研究表明我國胃癌患者發(fā)病及死亡人數(shù)已占全球胃癌病患總?cè)藬?shù)的50%，其發(fā)病率和死亡率分別位于我國惡性腫瘤疾病的第二位和第三位[1]，我國每年新發(fā)病例約40萬例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%。據(jù)報(bào)道，至2015年胃癌成為中國癌癥發(fā)病率和死亡率首位的惡性腫瘤[2]。因此，探討胃癌凋亡機(jī)理，尋找治療胃癌有效途徑是目前胃癌研究的一項(xiàng)重要課題。中藥治療腫瘤有療效確切、副作用少等無可比擬的優(yōu)勢[3]。中醫(yī)治療胃癌也由單純臨床報(bào)道進(jìn)入了較為系統(tǒng)的臨床與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的前瞻性研究，并且開始從分子機(jī)制揭示中藥治療胃癌的機(jī)制。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，國內(nèi)外在腫瘤凋亡研究上取得了較大進(jìn)展，凋亡受抑制是腫瘤發(fā)生發(fā)展中重要的病理現(xiàn)象，與腫瘤的治療密切相關(guān)[4～5]。因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是設(shè)計(jì)治療方案的重要思路。然而健脾解毒中藥能否參與凋亡相關(guān)線粒體通路與死亡受體通路這一科學(xué)問題仍未解決，因此這也是本課題將要探索的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑和儀器 健脾解毒方，藥物組成：黨參15 g，白術(shù)、半枝蓮、八月札各10 g，當(dāng)歸8 g，薏苡仁12 g，甘草5 g，生黃芪36 g。由河南省中醫(yī)藥研究院自制為片劑，用研缽搗成粉末，用DMSO配置濃度為100 mg/mL的母液備用。Thermo CO2培養(yǎng)箱；熒光定量PCR儀Roto-gene 6000(Corbett Research)，PCR 擴(kuò)增儀 2720 Thermal Cycler(Appiled Biosystem)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(杭州四季青公司)；B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞色素C(Cytochrome c)、自殺相關(guān)因子(Factor associated suicide，F(xiàn)as)、半胱氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)兔抗鼠抗體(Santacruze公司)；總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本 Takara公司)；Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8引物(上海生工生物工程有限公司)；化學(xué)發(fā)光試劑盒、化學(xué)發(fā)光成像儀(Tanon公司)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞活性 96孔板接種對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，接種濃度是5×104個(gè)/mL，以10、20、40μg/mL健脾解毒方分別作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24 h，加入MTT(1 mg/mL)，37℃，4 h，加入100μL DMSO，酶標(biāo)儀于570 nm處測吸光度。相對抑制率(%)=(1-給藥組吸光值/對照組吸光值)×100%。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率 6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，24 h后加入健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL)，加藥24 h后，收集細(xì)胞，AnnexinⅤ/PI染色，室溫下30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 JC-1染色檢測線粒體膜電位 酶標(biāo)儀檢測方法：將對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)，按每孔5×104個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL，培養(yǎng)24 h后，以10、20、40μg/mL的健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h，用PBS清洗細(xì)胞2次，5μg/mL JC-1染料37℃孵育細(xì)胞30 min。然后用PBS清洗細(xì)胞2次，用熒光酶標(biāo)儀定量分析。JC-1染料的激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為535 nm和595 nm。

1.6 qRT-PCR檢測SGC-7901中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA的表達(dá) 用6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，24 h后加入健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL)，加藥24 h后，吸掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入500μL/孔的Trizol，搖晃均勻，靜置5 min后反復(fù)吹打，收集細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中加入Trizol反復(fù)抽吸均勻，離心管中加入Trizol總體積的1/5量的氯仿，振蕩混勻30 s，室溫下靜置5 min，4℃條件下12 000×g離心15 min，分相為三層，上層清液為RNA(約為Trizol的60%)。小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL離心管中，有機(jī)相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì)，避免觸及，上清液加入與上清液等體積的異丙醇，上下顛倒混勻30 s。4℃靜置30 min，4℃條件下14 000×g離心15 min，RNA沉淀將在離心管底部形成。小心棄去上清液，離心管加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇-25%DEPC-H2O振蕩混勻30 s，使沉淀振蕩起來，4℃條件下16 000×g離心15 min。小心棄去上清液，防止RNA沉淀丟失，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥(10～20 min)。用DEPC水10μL溶解沉淀，反復(fù)吹打使其溶解。(注：RNA干燥后呈無色透明片狀，用水溶解后注意仔細(xì)淋洗離心管底部)，測量OD值后，樣品放置-70℃保存，保質(zhì)期一個(gè)月用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(見表1)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：Bax、Cytochromec、Fas、Caspase 8 95℃，預(yù)變性 5 min；95℃，變性 10 s；60℃，退火 30 s，72℃，延伸30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法，分析目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 檢測引物序列

1.7 Western-blot檢測Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 蛋白表達(dá) 6孔板培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞，用健脾解毒方(濃度分別為10、20、40μg/mL)處理SGC-7901細(xì)胞 24 h，收集細(xì)胞，離心5 min，PBS洗3次，每毫升加入100μL的細(xì)胞裂解液，置冰上裂解20 min，12 000×g離心6 min，取上清液，取等量總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVNF膜上，封閉液封閉1 h后，加入1抗于室溫2 h后，用TBST洗滌3次，加入2抗溫育1 h，最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，發(fā)光成像儀記錄結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用Graphpad Prism 6.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析(one-way ANOVA)，計(jì)量資料以(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度健脾解毒方對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用見表2，圖1。與對照組比較，20、40μg/mL健脾解毒方細(xì)胞抑制率較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并且呈劑量依賴性。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長情況，與對照組比較，10 μg/mL的健脾解毒方處理24 h后，SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)未有明顯改變；20μg/mL的健脾解毒方處理24 h后，SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，細(xì)胞變圓；40μg/mL的健脾解毒方處理后的細(xì)胞皺縮，數(shù)目明顯減少。

表2 不同濃度健脾解毒方對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s)

表2 不同濃度健脾解毒方對胃癌SGC-7901細(xì)胞的抑制作用(±s)

與對照組比較，①P＜0.05

組 別對照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3抑制率(%)-2 0.9 2±1.4 2 5 1.6 5±0.5 2①6 7.7 5±1.0 2①

圖1 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901細(xì)胞24 h形態(tài)的改變（×100）

2.2 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響 見表3，圖2。10、20、40μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞后，分別有5.98%、14.94%和31.88%細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。與對照組比較，10、20、40μg/mL健脾解毒方組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，并呈濃度依賴性，表明健脾解毒方能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡。

表3 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(±s)

表3 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響(±s)

與對照組比較，①P＜0.05

組 別對照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3細(xì)胞凋亡率(%)2.5 2±0.6 2 5.9 8±1.0 9①1 4.9 4±0.6 2①3 1.8 8±0.3 1①

圖2 細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

2.3 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對線粒體膜電位的影響見表4，圖3。隨著健脾解毒方濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位呈濃度依賴性下降(P＜0.05)。熒光酶標(biāo)儀測定結(jié)果顯示，不同濃度健脾解毒方給藥處理24 h后能夠降低細(xì)胞線粒體紅綠熒光比值。與對照組比較，不同濃度健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，細(xì)胞中JC-1單體形式逐漸增多，說明了線粒體膜電位下降，在40μg/mL健脾解毒方處理時(shí)線粒體膜電位下降最明顯。

表4 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對線粒體膜電位的影響(±s) %

表4 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對線粒體膜電位的影響(±s) %

與對照組比較，①P＜0.05

組別對照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 J C-1單體(r e d/g r e e n)1 0 0 9 7.7 2±0.5 9 7 9.6 4±0.5 5①4 5.1 2±1.0 1①

圖3 不同濃度健脾解毒方作用24 h后對線粒體膜電位的影響 (×400)

2.4 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響 見表5。與對照組比較，10、20、40μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，SGC-7901細(xì)胞中的Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的基因表達(dá)明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，并呈劑量依賴性。

表5 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響(±s)

表5 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8 mRNA表達(dá)的影響(±s)

與對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別對照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.4 7±0.1 3①1.6 6±0.3 2①3.2 5±0.4 8②C y t o c h r o m e c 1 1.2 3±0.6 2①2.3 7±0.5 7①3.1 6±0.3 9②F a s 1 1.1 8±0.3 7①1.9 2±0.5 8①2.7 8±0.3 3②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6①2.3 6±0.5 1①3.3 8±0.1 9②

2.5 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響 見表6，圖4。20、40 μg/mL健脾解毒方處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，Bax、Cytochromec、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)含量也增加(P＜0.05，P＜0.01)，且呈濃度依賴性。說明該藥物通過增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的蛋白表達(dá)，來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表6 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

表6 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901中Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8蛋白表達(dá)的影響(±s)

與對照組比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組 別對照組健脾解毒方(1 0 μ g/m L)健脾解毒方(2 0 μ g/m L)健脾解毒方(4 0 μ g/m L)n 3 3 3 3 B a x 1 1.1 8±0.2 1①1.6 9±0.4 2①2.4 1±0.5 5②C y t o c h r o m e c 1 1.3 4±0.7 6①2.7 3±0.6 6①4.5 7±0.5 3②F a s 1 1.3 8±0.4 1①2.6 2±0.4 9①3.8 2±0.5 8②C a s p a s e-8 1 1.0 7±0.2 6 1.3 7±0.4 2①1.6 3±0.2 6①

圖4 不同濃度健脾解毒方對SGC-7901細(xì)胞中蛋白表達(dá)的影響

3 討論

目前對于胃癌不適于手術(shù)或放化療治療的患者，采用保守治療，無論中藥還是西藥，其作用機(jī)制的研究都已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，總結(jié)起來主要有以下幾個(gè)方面：直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長[6]；調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[7]；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化[8]；調(diào)控胃癌基因的表達(dá)[9]；活化腫瘤細(xì)胞信號通路[10]。其中關(guān)于細(xì)胞凋亡與線粒體通路、死亡受體信號通路的研究是目前的研究熱點(diǎn)，眾多治療胃癌的有效中藥的作用機(jī)制也與以上兩方面有密切關(guān)系[11～13]。由此可見，線粒體通路、死亡受體信號通路參與細(xì)胞凋亡，在胃癌的治療上有舉足輕重的地位。

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是由機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化或死亡信號觸發(fā)，在基因調(diào)控下引起細(xì)胞主動死亡的過程，既是生物體維持自身穩(wěn)定和平衡的一個(gè)重要機(jī)制，也是消除異常增殖細(xì)胞的理想途徑，該途徑紊亂將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)育異常和加速腫瘤的發(fā)生和惡化[14]。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡信號通路包括2條：(1)線粒體信號通路：許多凋亡信號通過進(jìn)入線粒體，誘導(dǎo)線粒體內(nèi)的Cytochrome c等小分子釋放到胞漿，活化Caspase-9，活化的Caspase-9切割pro-caspase-3生成Caspase-3，從而誘導(dǎo)凋亡[15]；(2)死亡受體信號通路：一些凋亡刺激因素激活細(xì)胞膜外死亡受體，死亡受體進(jìn)一步活化膜上Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域，結(jié)合并活化半活化Caspase-8，活化的Caspase-8進(jìn)一步切割pro-caspase-3生成Caspase-3，從而誘導(dǎo)凋亡[16]。在細(xì)胞凋亡通路中，線粒體扮演著重要角色，表現(xiàn)在：(1)釋放Caspases激活因子如Cytochrome c[17]；(2)喪失電子傳遞鏈功能，ATP生成減少，細(xì)胞能量不平衡[18]；(3)線粒體膜電位消失，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生[19]；(4)承載Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[17]。其中線粒體釋放Cytochrome-c，是Caspases自身正反饋激活鏈中關(guān)鍵步驟。Fas是該死亡區(qū)域的重要受體之一，F(xiàn)asL是同源三聚體分子，活化后通過“死亡結(jié)構(gòu)域”與接頭分子Fas相關(guān)死亡域蛋白(Fas-assoeiated death domain，F(xiàn)ADD)結(jié)合而引起FADD構(gòu)象變化，進(jìn)而募集Caspase-8、Caspase-10形成復(fù)合物 DISC(death-inducing signaling complex)引 起 Caspase-8、Caspase-10自身剪切激活，啟動下游Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-6、Caspase-3、Caspase-7引發(fā)了細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)健脾解毒方能夠通過增加Bax、Cytochrome c、Fas、Caspase-8的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示：健脾解毒方在40μg/mL濃度能夠有效的降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位，影響線粒體正常功能，并通過增加Cytochrome c的釋放、刺激Fas蛋白的表達(dá)、激活Caspase-8的表達(dá)，促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，顯示健脾解毒方可能通過線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑來發(fā)揮抗腫瘤的作用。