趙春海

(濱州職業(yè)學(xué)院,山東 濱州 256603)

單寧屬于天然多酚類物質(zhì),廣泛存在于植物的莖葉和果實中。單寧是食物和飼料中澀味的主要來源。單寧包含多個酚羥基,能與蛋白質(zhì)的亞胺基交聯(lián)成鍵,形成疏水性沉淀。飼料中單寧與口腔黏膜、唾液以及消化道中的蛋白質(zhì)結(jié)合,高濃度的單寧不利于飼料中營養(yǎng)價值的吸收和利用,單寧也能與金屬元素結(jié)合,從而降低對礦物元素利用,食物和飼料中都必須控制單寧的濃度,高濃度單寧必須降解去除[1-4]。

降解單寧的主要有3種方法:物理法(高溫處理)、化學(xué)法(有機(jī)溶劑)和生物酶法。其中物理方法耗能高,且乃能消除70%的單寧?；瘜W(xué)法主要添加有機(jī)溶劑來降低單寧含量,安全性低且容易造成環(huán)境污染[5-7]。利用酶法降低單寧含量操作簡單,并且節(jié)能環(huán)保,在生產(chǎn)生活中具有重要價值[8-10]。

單寧酶(EC 3.1.1.20)能水解單寧物質(zhì)中的酯鍵,生成沒食子酸、葡萄糖及其他醇類化合物。單寧酶是美國食品與藥物管理局(food and drug administration,FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用的安全食品,我國已將其列入食品添加劑名錄。在單寧酶的基礎(chǔ)研究及工業(yè)應(yīng)用方面,美國、日本研究得較早。國內(nèi)對單寧酶的研究較晚,隨著市場需求量的不斷增加,急需從菌種、生產(chǎn)工藝進(jìn)行突破,因此,開展微生物發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的工藝研究,提高酶活性、穩(wěn)定性,相對降低酶的價格,對于擴(kuò)大單寧酶的生產(chǎn)規(guī)模,助推國內(nèi)單寧酶的工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義[11-15]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

自行分離,來源于東海、南海、渤海灣的海水、海泥、動植物體表與動物腸道。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種分離培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,海水1 L,氯霉素0.1 g/L,pH自然,瓊脂20 g/L,115℃滅菌30 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母粉10 g/L,115℃滅菌30 min。

產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基:單寧20 g/L,硝酸銨10 g/L,瓊脂30 g/L,溴酚藍(lán)0.002 g/L,115℃滅菌30 min。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基:單寧酸10 g/L,硝酸銨20 g/L,葡萄糖20 g/L,pH 5.0,115℃滅菌30 min。

糖發(fā)酵測試培養(yǎng)基:葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、麥芽糖、木糖制備形成100 g/L的糖母液。將上述糖母液分別裝入小試管中,并加入酵母粉,最終控制糖質(zhì)量濃度為20 g/L,酵母粉質(zhì)量濃度為10 g/L,每個發(fā)酵糖做3個平行,發(fā)酵糖試管中加入一個杜氏小管,115℃滅菌30 min。

同化碳源培養(yǎng)基:(NH4)2SO45 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,酵母膏0.2 g/L,瓊脂20 g/L,115 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

0.05 mol/L甲醇羅丹寧溶液,0.01 mol/L沒食子酸丙酯,0.5 mol/L KOH溶液,0.1 mol/L檸檬蘇-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-180生化培養(yǎng)箱:上海丙林電子科技有限公司;Microfuge1-16K離心機(jī):德國Sigma公司;PHSJ-3FpH數(shù)字式酸度計:上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;OlimpusCX23顯微鏡:上海賴氏電子科技有限公司;UV-2102 C型紫外分光光度計:上海圣科儀器設(shè)備有限公司;5334聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction,PCR)儀:德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酶菌種的初篩

采集樣品預(yù)處理后,制備菌懸液涂布產(chǎn)酶篩選固體培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)2 d,觀察微生物生長情況,選擇單菌落點轉(zhuǎn)接在產(chǎn)酶篩選固體培養(yǎng)基上,再培養(yǎng)3 d,觀察形成水解圈的情況。通過測量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d),以D/d值作為初篩依據(jù),篩選產(chǎn)酶能力較高的菌株。

1.3.2 單寧酶活力測定

產(chǎn)酶能力較高的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)酵液16 000 r/min離心10 min得到粗酶液。比色管中分別加入0.5mL沒食子酸丙酯溶液,以0.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉緩沖液為空白對照,測試管加入0.5mL粗酶液,酶解條件為30℃處理5 min,在酶解和對照管中分別加入1.0 mL 0.05 mol/L羅丹寧溶液,30℃處理5 min。在酶解和對照管中加入0.5 mol/L KOH溶液0.5 mL,30℃處理5 min。反應(yīng)結(jié)束后將5 mL蒸餾水分別加入酶解管和對照管中,30℃處理5 min。充分混勻后在波長520nm處測定吸光度值,單寧酶活力根據(jù)吸光度值的變化來計算[16-20]。

酶活定義:在pH5.5、30℃的條件下,每分鐘產(chǎn)生1μmol/L沒食子酸所需要的酶量作為1個酶活單位(U)。

1.3.3 菌種的生理生化鑒定

分別進(jìn)行糖發(fā)酵測試與碳源同化測試。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定

(1)對分離的產(chǎn)酶菌株進(jìn)行基因組提取,在生理生化基礎(chǔ)上進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。根據(jù)分離菌株的ITS測序結(jié)果,與GenBank數(shù)據(jù)庫中保存的已知標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行同源比對,根據(jù)與已知菌株同源序列比對結(jié)果通過軟件構(gòu)建ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

(2)海洋菌株95 ITS序列的PCR擴(kuò)增[8-9]:

ITS序列擴(kuò)增的引物為:正向引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';反向引物5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',采用該引物進(jìn)行PCR體外擴(kuò)增,目標(biāo)產(chǎn)物大約為550 bp。

(3)菌株產(chǎn)酶曲線的測定

產(chǎn)酶菌株在YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)作為種子液,以5%的量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基在28℃、160r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h,每隔12 h取發(fā)酵液16 000 r/min離心10 min,做3個平行樣,測定發(fā)酵單寧酶活性,并繪制菌株產(chǎn)酶曲線。

1.3.5 粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究

產(chǎn)酶菌株接種于液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)12 h作為種子液,以5%的量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基在28℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)72 h,取發(fā)酵液離心獲得粗酶液。

(1)溫度對胞外單寧酶酶促反應(yīng)的影響[22]

粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下進(jìn)行酶促反應(yīng),保持pH=5條件下,分別測定不同溫度下酶活性,每個條件測定3次,計算相對酶活。

(2)胞外單寧酶粗酶液的熱穩(wěn)定性[23]

粗酶液穩(wěn)定性試驗,將樣品分別在4℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下放置4h,迅速冷卻后,然后在30℃、pH=5.5條件下測定酶活力,計算相對酶活。

(3)pH對酶促反應(yīng)的影響

以pH=3、4、5、6、7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制反應(yīng)底物,加入粗酶液在30℃下進(jìn)行反應(yīng),測定酶活力,計算相對酶活。

(4)胞外單寧酶粗酶的pH穩(wěn)定性

粗酶加到pH=3、4、5、6、7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在4℃條件下放置4 h,在30℃、pH=5.5條件下測定酶活力,計算相對酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

將分離樣品在YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),取50mL菌液點在篩選培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)48 h,結(jié)果如圖1所不,透明圈與菌落直徑比(D/d值)見表1。結(jié)果表明,不同菌種在平板上的生長情況差異明顯,81號菌落周圍透明圈很小,82號菌生長緩慢,未形成明顯透明圈。86號菌落周圍出現(xiàn)了明顯的透明圈,其半徑小。75號菌落接種量較大,菌落變形,菌落周圍呈現(xiàn)出清晰的透明圈。95號菌落生長較好,透明圈清晰且較大。參照D/d值,選擇95號菌作為研究對象,進(jìn)行產(chǎn)酶研究。

圖1 不同菌株菌落平板水解結(jié)果Fig.1 Results of colony plate hydrolysis of different strains

表1 不同菌株透明圈與菌落直徑的比Table1 Ratio of transparent circle to colony diameter of different strains

2.2 菌株的菌落和細(xì)胞形態(tài)

將菌株95號接種至固體YPD平板上,在28℃培養(yǎng)48 h,觀察平板上的菌落,通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果見圖2。從圖2-A可以看出,菌株95號菌落呈星狀,酵母菌常有的乳白色,菌落邊緣不規(guī)則,較濕潤,菌落與營養(yǎng)機(jī)制結(jié)合緊密;從圖2-B可以看出,顯微鏡下直接觀察菌株75號細(xì)胞形橢圓形,單個分散,有明顯的芽殖體。

圖2 菌株95號的菌落形態(tài)(A)和細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.2 Colony morphology(A)and cell microscopy(B)of strain 95#

根據(jù)酵母菌鑒定方法,糖發(fā)酵和碳源同化試驗是菌株鑒定的兩個重要試驗,分離菌株95號的糖發(fā)酵試驗情況見表2,碳源同化情況見表3。

表2 菌株95號的碳源發(fā)酵結(jié)果Table2 Carbon fermentation results of strain 95#

表3 菌株95號的碳源同化結(jié)果Table3 Carbon assimilation results of strain 95#

由表2和表3可知,菌株95號能夠同化多種糖類,但不能夠同化乳糖。根據(jù)同化與發(fā)酵結(jié)果,并與酵母鑒定手冊的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,測試菌株95號與Aureobasidium subglaciale標(biāo)準(zhǔn)菌株的碳源發(fā)酵和同化結(jié)果一致。

2.3 分子鑒定

ITS序列進(jìn)行比對的結(jié)果均表明,單寧酶菌株95與Aureobasidium subglaciale的序列最為接近,數(shù)據(jù)結(jié)果相似性高達(dá)99%以上,以標(biāo)準(zhǔn)菌株為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行進(jìn)化樹繪制,結(jié)果見圖3。

圖3 菌株95號的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 95＃

由圖3可知,單寧酶菌株95與Aureobasidiumsubglaciale聚類到同一支,分子生物學(xué)中ITS鑒定與生理生化鑒定結(jié)果一致,最終將分離獲得海洋單寧酶菌株95號確定為Aureobasidiumsubglaciale。目前曲霉屬是報道中最主要的生產(chǎn)單寧酶菌種[2,10,12,13,16,22],Aureobasidium subglaciale未曾有報道,此外KUMARM等[9-10]從克雷白氏桿菌(Klebsiella),分離獲得了目前來源于細(xì)菌的最小分子質(zhì)量的嗜熱單寧酶,最優(yōu)催化溫度為50℃,極小阿托波氏菌也被報道可以進(jìn)行單寧酶的生產(chǎn)[18]。

2.4 菌株95號產(chǎn)酶曲線的測定

菌株95號產(chǎn)酶菌株在YPD液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)作為種子液,以5%的量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基在28℃、160 r/min條件下振蕩培養(yǎng),其發(fā)酵產(chǎn)酶曲線見圖4。由圖4可知,菌株95號在發(fā)酵前24 h產(chǎn)酶很低,從24 h開始驟然升高,也與菌體密度保持一致,發(fā)酵72 h在胞外達(dá)到最大活力323.2 U/mL。已報道[8,10,12,17,20]的產(chǎn)單寧酶菌株酶活普遍低于300 U/mL,菌株95號活力較高,且產(chǎn)酶周期類似,說明菌株95號是較好的產(chǎn)酶菌株。

圖4 菌株95號發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig.4 The enzyme production curve of strain 95＃fermentation

2.5 酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 溫度對胞外單寧酶酶促反應(yīng)的影響

粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)4 h,保持pH=5測定酶活力,每個試驗做3個平行樣,以50℃下的活力為100%,計算各樣品相對酶活力,結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對胞外單寧酶活力的影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity of extracellular tannase

由圖5可知,該酶最適反應(yīng)溫度為60℃,在40～70℃之間能保持較高的酶促反應(yīng)速率。當(dāng)反應(yīng)溫度升高且低于50℃時,酶促反應(yīng)的底物能量增加同時活化的分子數(shù)增多,提高了分子間的碰撞概率,使得同等條件下酶促反應(yīng)速度加快;而酶蛋白在過高的溫度下結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化,逐漸變性,活性降低。根據(jù)文獻(xiàn)報道[21-22],多數(shù)單寧酶在0～45℃之間保持較高的酶活性。可見菌株95號所產(chǎn)的單寧酶保持活力的溫度范圍更寬,有較強的應(yīng)用潛力[4,6,7,10]。

2.5.2 胞外單寧酶的熱穩(wěn)定性

以常見低溫保藏酶溫度4℃開始、選擇30℃、40℃、50℃、60℃、70℃分別保存粗酶液4 h,流水迅速冷卻后,然后在30℃、pH=6條件下測定酶活力,以初始活力為100%,計算各樣品的相對酶活力,結(jié)果如圖6。由圖6可知,在30℃、40℃、50℃水浴保溫4 h,相對酶活力為80%以上,從60℃開始活力下降明顯。此外該單寧酶在30～60℃條件下保溫4 h活力無明顯下降,70℃溫度較高,酶已經(jīng)失活。已報道[23-24]的多數(shù)單寧酶在60℃保溫1 h,酶活力幾乎完全喪失,本研究得到的胞外單寧酶熱穩(wěn)定性高于現(xiàn)有絕大多數(shù)單寧酶,可滿足食品加工工藝中處理時間的要求。

圖6 溫度對胞外單寧酶酶的熱穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the thermal stability of extracellular tannase

2.5.3 pH對酶促反應(yīng)的影響

以pH=3、4、5、6、7、8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制反應(yīng)底物,加入粗酶在30℃條件下進(jìn)行反應(yīng),以pH 6條件下的活力為100%,計算各樣品相對酶活力,結(jié)果見圖7。如圖7所不,胞外單寧酶最適反應(yīng)pH為6,pH在3～7之間均有較高反應(yīng)速率。這與文獻(xiàn)報道[18,20,22]的大部分單寧酶酶促反應(yīng)最適pH在4.5～6.0之間相符。

圖7 pH值對酶促反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of pH value on enzymatic reaction

2.5.4胞外單寧酶的pH穩(wěn)定性

粗酶加到檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=3、4、5、6、7)在4℃條件下放置4 h,在30℃、pH=6條件下,以初始活力為100%,計算各樣品的相對酶活力結(jié)果見圖8。該單寧酶具有較廣的pH值穩(wěn)定性,在pH值4～7之間相對酶活為60%以上。文獻(xiàn)報道單寧酶多為酸性蛋白,其性質(zhì)可能與此相關(guān)。

圖8 胞外單寧酶酶的p H值穩(wěn)定性Fig.8 Stability of pH value of extracellular tannase

3 結(jié)論

本研究從海洋微生物中篩選到高產(chǎn)單寧酶的菌株95號,綜合生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,該菌株鑒定為Aureobasidium subglaciale,其在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h達(dá)到最大活力323.2 U/mL,與其他產(chǎn)單寧酶微生物相比達(dá)到了較高的產(chǎn)酶水平。該菌株所產(chǎn)單寧酶最適反應(yīng)溫度為50℃,該酶在30℃、40℃、50℃水浴保溫4 h,相對酶活80%以上,具有較好的熱穩(wěn)定性;單寧酶最適反應(yīng)pH和最穩(wěn)定pH均為6,同時酶具有較廣的pH值穩(wěn)定性。本研究中的單寧酶保持活力的條件較為廣泛,與茶葉加工、果汁制作的工藝條件接近,所以此單寧酶在去除茶葉冷后渾濁、果汁飲料除澀方面有較好的應(yīng)用優(yōu)勢。Aureobasidiumsubglaciale單寧酶的發(fā)酵研究,拓寬了單寧酶種植資源,同時本研究中的單寧酶具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,有較大的應(yīng)用潛力。