胡佳音,周 森,王 瑛,趙衛(wèi)鵬,朱婷婷,魏金旺*

(北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠,北京 101301)

牛欄山二鍋頭屬于清香型白酒,其釀造過程是開放式的多菌種固態(tài)發(fā)酵,以高梁等谷物為原料,大曲為糖化發(fā)酵劑,采用清蒸清茬、固態(tài)地缸發(fā)酵、清蒸流酒[1]的釀造工藝,開放式的釀造方式使其網(wǎng)羅自然界的多種微生物,形成了專屬牛欄山二鍋頭的獨特菌群。

在白酒釀造中細菌是不可或缺的一類微生物,其往往具有數(shù)量較多、種類豐富等特點,常被認(rèn)為是“生香動力軍”[2]。在牛欄山二鍋頭釀造過程中,細菌主要分為乳酸菌、芽孢桿菌和放線菌三大類群[3]。目前,對白酒微生物的研究方法主要分為傳統(tǒng)微生物分離和微生物非培養(yǎng)方法,傳統(tǒng)微生物分離是白酒微生物研究中較為常用的技術(shù)手段,它主要適用于發(fā)酵中可培養(yǎng)類微生物,可以有效地確定微生物數(shù)量的變化規(guī)律并獲得活體菌株,如王慶宇等[4]采用多種培養(yǎng)基對老白干制曲過程中多種培養(yǎng)基進行微生物分離,確定不同培養(yǎng)基對大曲中一般性細菌、乳桿菌、乳球菌、霉菌、酵母菌具有較好的分離效果。近幾年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和在復(fù)雜環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用,基于現(xiàn)代分子生物技術(shù)的微生物非培養(yǎng)方法研究逐漸成為熱點[5],如高亦豹等[6]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerasechain reaction-denaturinggradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)方法分析了我國白酒高溫和中溫大曲細菌群落結(jié)構(gòu),得出不同工藝大曲細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異;唐婧等[7]利用高通量測序分析了茅臺酒曲微生物多樣性,確定了茅臺大曲中的細菌組成;鄧杰等[8]利用高通量測序技術(shù)分析了濃香型白酒窖池窖泥細菌群落結(jié)構(gòu),建立了一套完整的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法并獲得不同窖齡窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)。

本研究利用傳統(tǒng)微生物分離和高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法,分析了牛欄山二鍋頭大茬酒醅發(fā)酵過程中細菌結(jié)構(gòu)的變化。確定了釀造過程中細菌的變化規(guī)律及優(yōu)勢微生物,為清香型白酒優(yōu)良細菌微生物的篩選及其功能性研究提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

牛欄山二鍋頭大茬酒醅:牛欄山酒廠冬季第一次入缸發(fā)酵的高粱。

1.1.2 試劑

三氯甲烷、異戊醇、異丙醇(均為分析純):上海生工生物工程有限公司;Fast DNA SPIN Kit for Soil(MPbio土壤基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)提取試劑盒):北京比特博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌分離培養(yǎng)基:采用乳酸細菌(MRS)培養(yǎng)基。牛肉膏10 g,酪蛋白胨30 g,酵母提取物5 g,葡萄糖20 g,乙酸鈉5g,檸檬酸氫二胺2g,吐溫801 mL,MgSO4·7H2O 0.58 g,K2HPO42 g,MnSO4·H2O 0.25 g,萘啶酮酸50 mg,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。

芽孢桿菌分離培養(yǎng)基:采用肉汁(nutrient broth,NB)培養(yǎng)基。蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 L。

放線菌分離培養(yǎng)基:采用鏈霉菌培養(yǎng)基2號(ISP2)培養(yǎng)基。酵母提取物4 g,麥芽提取物5 g,D-葡萄糖4 g,萘啶酮酸50 mg,瓊脂18 g,蒸餾水1 L,pH 7.3。

細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基:采用LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,氯化鈉10 g,蒸餾水1 L。

以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1100ⅡA2型生物安全柜:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;C1000快速梯度基因擴增儀、基礎(chǔ)型水平電泳儀、全自動凝膠成像儀:美國BIORAD公司;1-14k高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司;SPX-320型生化培養(yǎng)箱:寧波江南儀器廠;MPFastPrep-24樣品快速制備系統(tǒng):美國MP公司;L95系列智能溫度記錄儀:上海發(fā)泰精密儀器表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大茬酒醅發(fā)酵溫度曲線的測定

將溫度記錄儀探頭埋入地缸中心點,距地缸表面60 cm處,記錄大茬酒醅發(fā)酵過程中溫度的變化過程。

1.3.2 大茬酒醅細菌分離

取樣:根據(jù)大茬酒醅發(fā)酵溫度曲線的特點,從整個發(fā)酵周期28d中確定6個時間點采集樣品,選取同批次發(fā)酵的三缸作為取樣缸(平行樣品),標(biāo)記為A缸、B缸、C缸,入池0 d的樣品乃取一份,其余5份樣品取樣位置為地缸中心點與缸壁之間,距地缸表面60 cm深處,樣品編號為D5A、D5B、D5C(D5代表取樣時間),其余取樣點以此類推。

分離:分別稱取不同釀造時間的酒醅樣品10g于90 mL無菌水中稀釋,擬定為10-1梯度。依次稀釋為10-2、10-3、10-4、10-5梯度,根據(jù)發(fā)酵時間吸取不同梯度稀釋液0.1 mL涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板。分離方法及培養(yǎng)條件如表1所不。

表1 大茬酒醅中微生物的分離培養(yǎng)基及方法Table1 Isolation mediums and methods of microorganisms in Dacha fermented grains

計數(shù):培養(yǎng)時間根據(jù)菌落的生長情況而定,一般為24～48 h,一般選擇菌落數(shù)在20～300 CFU/mL之間的平板進行計數(shù)。在這個范圍之外則不能正確地指不樣品中微生物的真實數(shù)量。具體計數(shù)原則如下:

為了避免虛假精確度的產(chǎn)生,當(dāng)進行活菌計數(shù)時,保留一位有效數(shù)字,按照四舍五入原則對其進行取舍。每毫升菌落形成的單位(colony formingunit,CFU)=同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×10,根據(jù)稀釋倍數(shù)統(tǒng)計不同培養(yǎng)基中微生物的種群數(shù)量,獲得發(fā)酵過程中細菌微生物數(shù)量變化規(guī)律[9]。

1.3.3 大茬酒醅高通量測序

(1)大茬酒醅總DNA的提取

分別稱取不同發(fā)酵時期的大茬酒醅樣品1 g,用快速樣品制備系統(tǒng)(Fastprep)處理后,采用MPbio土壤基因組DNA提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil)提取不同發(fā)酵時期大茬酒醅的基因組。

(2)大茬酒醅的高通量測序

所提DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送往北京奧維森公司,利用IlluminaMiSeq對細菌的16SrDNA V3/V4區(qū)序列進行高通量測序,測序引物為正向引物:5'-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3';反向引物:5'-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。原始測序序列通過軟件Fastqc進行質(zhì)量檢測去除低質(zhì)量Reads(過濾標(biāo)準(zhǔn):Q20≥90%)。通過(connectingoverlappedpair-end,COPE)軟件進行序列拼接、過濾。利用Mothur軟件以平均鄰近聚類算法(average neighbor clusteringalgorithm)在0.03(或97%的相似度)水平下對Clean Tags進行操作分類單元(operationaL taxonomic units,OTU)的聚類,統(tǒng)計每個樣品每種OTU中的豐度信息。選取分析數(shù)據(jù)中每個OTU中一個有代表性的序列進行Blast比對,獲得每一個OTU所代表的種名[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大茬酒醅發(fā)酵溫度曲線

大茬酒醅的發(fā)酵溫度曲線如圖1所不。

圖1 大茬酒醅發(fā)酵溫度曲線及取樣點Fig.1 Fermentation temperature curve of Dacha fermented grains and sampling points

由圖1可知,酒醅升溫曲線較為理想,呈現(xiàn)前緩升、中挺、后緩落的趨勢,即0～9 d屬于溫度前緩升階段,溫度的緩慢上升利于控制微生物生長速度,防止酒醅生酸過猛,維持正常發(fā)酵的進行;9～13 d為中挺階段,溫度較為穩(wěn)定,是前緩升階段和后緩落階段的交接期;13～28 d為后緩落期,溫度緩慢降低,該階段酒精發(fā)酵基本結(jié)束,主要以生香為主。因此本研究所選取的6個取樣點分別為0 d、5 d、9 d、13d、19d、28d,涵蓋了發(fā)酵的3個階段,具有較好的代表性[13]。

2.2 大茬酒醅細菌數(shù)量變化規(guī)律

分別對發(fā)酵過程中乳酸菌、芽孢桿菌、常規(guī)細菌和放線菌4類細菌進行數(shù)量跟蹤,其中放線菌數(shù)量較少,僅在入池0 d和13d稀釋梯度為10-1的樣品中分離檢測到,不具備規(guī)律性,所以本研究乃討論發(fā)酵過程中乳酸菌、芽孢桿菌和常規(guī)細菌變化規(guī)律,結(jié)果見圖2。

由圖2可知,在入池階段,酒醅中含有大量的乳酸菌(10.6 lg(CFU/g)),遠高于芽孢桿菌(5.8 lg(CFU/g))和常規(guī)細菌(5.7 lg(CFU/g)),是入池階段的主要細菌。隨著發(fā)酵的進行,在緩升階段(0～9 d),乳酸菌快速增長,菌落總數(shù)由10.6 lg(CFU/g)增長至14.5 lg(CFU/g);在中挺階段(9～13 d)及后緩落期(13～28 d),乳酸菌數(shù)量仍緩慢增長,在發(fā)酵19d時,乳酸菌數(shù)量達到最高值,為15.53lg(CFU/g);發(fā)酵28d時,乳酸菌數(shù)量出現(xiàn)了少量降低。入池發(fā)酵后,芽孢桿菌數(shù)量緩慢降低,發(fā)酵5 d,芽孢桿菌數(shù)由5.80 lg(CFU/g)下降至5.02lg(CFU/g);發(fā)酵5d后,芽孢桿菌數(shù)量緩慢增長,菌落總數(shù)在出池階段達到最高值,為5.92lg(CFU/g)。常規(guī)細菌數(shù)量由入池階段的5.71 lg(CFU/g)緩慢增長至出池階段的最高值5.99 lg(CFU/g)。與乳酸菌相比,芽孢桿菌和常規(guī)細菌數(shù)量增長僅為0.11lg(CFU/g)和0.28lg(CFU/g),說明二鍋頭發(fā)酵過程中芽孢桿菌和常規(guī)細菌數(shù)量基本穩(wěn)定,變化幅度較小。整體分析得出,牛欄山二鍋頭酒醅發(fā)酵過程中芽孢桿菌和常規(guī)細菌數(shù)量基本穩(wěn)定,乳酸菌是發(fā)酵過程主體細菌類微生物。

圖2 大茬酒醅發(fā)酵期間細菌數(shù)量的變化Fig.2 Changes of the bacterial population in Dacha fermented grains during fermentation process

2.3 高通量測序分析

通過高通量測序,共獲得559種細菌OTU,主要包括乳桿菌科(Lactobacillaceae)、高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)和醋桿菌科(Acetobacteraceae)。篩選出占總reads比例＞1%的微生物進行分析,結(jié)果見表2。

表2 菌種的數(shù)量比例Table2 Proportion of bacteria

由表2可知,酒醅發(fā)酵過程中,占總reads比例＞1%的細菌共有14種,主要由3種類群組成,包括1種高溫放線菌(Thermoactinomyces)、1種醋酸菌(Acetobacter pasteurianus)和12種乳酸菌,14種細菌reads之和可占發(fā)酵過程總reads數(shù)的91.82%,因此可以確認(rèn)其能夠較為全面的反應(yīng)大茬酒醅發(fā)酵過程中細菌類群的變化規(guī)律。

根據(jù)不同的發(fā)酵時間對14種細菌進行分析,獲得發(fā)酵過程細菌多樣性變化情況,結(jié)果如圖3所不。

圖3 基于高通量測序結(jié)果大茬酒醅中細菌物種多樣性和演替Fig.3 Bacterial diversity and succession in Dacha fermented grains based on high-throughput sequencing results

由圖3可知,在入池階段(0 d),大茬酒醅中主要細菌為融合維斯氏菌(Weissella confusa)、巴氏醋酸菌(Aceto bacter pasteurianus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)和others(14種以外的細菌),說明在入池階段,大茬酒醅中含有隨大曲及環(huán)境帶入的多種細菌類微生物;緩升階段(0～9 d)是二鍋頭釀造的生酸階段,在該階段乳酸菌快速增長,戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、黑龍江乳桿菌(Lactobacillus heilongjiangensis)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和W.confusa逐漸成為了酒醅內(nèi)主體細菌,乳酸菌大量增長所生成的有機酸類有助于提高酒醅的酸度,維持發(fā)酵的正常進行,也為乳酸乙酯的合成提供了前體物質(zhì);中挺階段(9～13 d)是酒精發(fā)酵的主發(fā)酵階段,占整個發(fā)酵周期酒精生成量的90%以上,較高的酒精含量抑制了乳酸菌的生長,使乳酸菌數(shù)量和種類維持穩(wěn)定,主要以P.pentosaceus、L.heilongjiangensis、L.parabuchneri和L.brevis為主;發(fā)酵后緩落期(13～28 d)是各種香味成分相互融合、相互轉(zhuǎn)化的過程,可使酒質(zhì)更加醇厚綿柔,回味綿長,在該階段酒醅中乳酸菌數(shù)量稍有增長且種類出現(xiàn)更替,耐酸乳桿菌(Lactobacillusacetotolerans)成為了發(fā)酵后緩落期的主體細菌類微生物,在出池樣品中其可占細菌比例的71.37%～74.8%。目前,對于二鍋頭酒中耐酸乳桿菌的研究較少,其在釀造后緩落期的具體作用還尚不明確,還需要進一步研究[14]。

3 結(jié)論

本研究利用傳統(tǒng)分離技術(shù)和高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對牛欄山二鍋頭大茬酒醅發(fā)酵期間的細菌多樣性進行研究,從微生物數(shù)量演替和種屬多樣性變化兩方面,系統(tǒng)解析了牛欄山二鍋頭酒醅發(fā)酵過程中細菌群落的演替規(guī)律。研究結(jié)果表明,乳酸菌在發(fā)酵過程中,數(shù)量大量增長,在發(fā)酵的前緩、中挺、后緩落3個階段,不同種屬乳酸菌分別成為發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌,而芽孢桿菌和其余細菌數(shù)量基本維持穩(wěn)定,且在高通量種屬比例中占有量較低;同時,高通量數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)高溫放線菌(Thermoactinomyces)在發(fā)酵前緩生階段占有一定比例,且目前在清香型白酒中未見報道,僅在芝麻香高溫大曲中發(fā)現(xiàn)[15],說明了在牛欄山二鍋頭酒醅釀造過程中存在一定量的高溫類放線菌類群,而其在發(fā)酵過程中的具體作用,還需進一步分析驗證。