魏 旭，韓君萍，虞躍躍，李 雙，趙 葉，楊金華，崔建美

(華北理工大學，河北 唐山 063000)

支氣管哮喘是當今社會常見的慢性疾病之一，是一種以多種炎癥細胞和一系列細胞因子參與為特征的氣道慢性炎癥性疾病[1]。臨床表現(xiàn)為呼氣性呼吸困難、反復發(fā)作性喘息、咳嗽或胸悶等癥狀，每于夜間和(或)清晨發(fā)作。據(jù)世界各國流行病學調查結果顯示，目前全球約有3億哮喘患者，其中兒童患病率在3.3%～29%，成人患病率在1.2%～25.5%[2-3]，被世界衛(wèi)生組織列為四大頑癥之一。針刺防治哮喘療效確切，副作用小，費用相對較低，逐漸成為我國防治哮喘的特色之一。邵氏“三穴五針法”由邵經明教授所創(chuàng)，即以雙側肺俞穴、風門穴及單穴大椎為主穴的針刺療法[4-5]，邵氏“三穴五針法”是在多年的臨床實踐與研究中總結而成的治療方法，在治療哮病的臨床應用中效果顯著[6-7]，然而其治療哮喘的作用機制尚未完全明確[8]。本實驗采用HE染色法、免疫組化法等觀察“三穴五針法”針刺對支氣管哮喘大鼠肺組織病理改變及Eotaxin、RANTES的影響，以探討“三穴五針法”治療哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠30只(購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號：SYXK2015-0038)，雄性，(120±10)g。大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學實驗動物中心屏障環(huán)境，動物實驗設施(使用證明：MY10DXK07)，溫度設定20℃～25℃，濕度設定60%～70%。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》(2006)的相關規(guī)定。

1.2 試劑和儀器

卵蛋白(A5503-10G，美國Sigma公司)；兔抗大鼠Eotaxin抗體(A7569，abclonal)；山羊血清(792740，Blological Industries)；兔抗大鼠RANTES抗體(A5630，abclonal)；兔抗大鼠熒光二抗(100944，KPL)；DAPI(035M4029V，SIGMA)；霧化吸入器(085G3005，德國PARI)；生理記錄儀；切片機(RM223型，德國萊卡)；一次性無菌針灸針(華佗牌)；熒光防淬滅封片劑(150529，KPL)；酶標儀(M200PRO，TECAN)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將30只SD大鼠(SPF級)隨機分為3組，每組各10只，具體分組如下：①正常對照組：用生理鹽水代替卵蛋白(OVA)；②哮喘模型組：按大鼠哮喘模型制備方法進行造模，但不給予針刺處理；③針刺干預組：自造模之日起采用“三穴五針法”給予針刺處理。

1.3.2 制備哮喘大鼠模型 哮喘模型組及針刺干預組SD大鼠腹腔注射生理鹽水配制的卵蛋白(OVA)懸液1 mL[含1 mg卵蛋白(OVA)和10 mg Al(OH)3凝膠]，并于第8天重復注射1次，第9天開始用1%OVA混懸液霧化吸入激發(fā)，每次30 min，每日1次，激發(fā)4周。正常對照組大鼠腹腔注射及霧化吸入相同劑量的生理鹽水，且時間地點與哮喘模型組保持一致[9]。

1.3.3 “三穴五針法”針刺干預 自造模之日起開始針刺，穴位選取大椎、雙側風門和雙側肺俞，進針后予以平補平瀉手法，5 min行針1次(捻轉速度200次/min，捻針20次為行針1次)，留針20 min，隔日1次，共針刺4周。

1.3.4 氣道阻力與肺順應性測定 用10%的水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，將氣管和食管切開后插管，然后用數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)連接(上海醫(yī)科大學生理實驗室提供)記錄供測定潮氣量(VT)、氣流速率(V)和呼吸頻率。經計算機圖像、數(shù)據(jù)分析處理得到氣道阻力(R)和肺順應性(C)。

1.3.5 肺組織病理學觀察 3組大鼠分別檢測氣道阻力后，迅速結扎大鼠右肺中葉，右心室頭皮針插管并在左心耳剪開一切口，用無菌生理鹽水快速行肺循環(huán)灌注至雙肺蒼白色。將心肺和氣管完整取出，剝離肺，生理鹽水漂洗干凈，吸水紙拭干。剪出結扎的右肺中葉，進行HE染色：4%多聚甲醛固定肺組織標本，24 h后清水沖洗過夜，梯度乙醇脫水、透明，浸蠟組織，石蠟包埋，連續(xù)切片(4 μm厚度)。HE染色后顯微鏡下觀察炎性細胞的浸潤及肺組織結構的病理改變。

1.3.6 免疫組化檢測肺組織中Eotaxin、RANTES蛋白的表達 將石蠟切片按以下步驟操作：①65℃烤片機上烤片40 min，室溫放置5 min；②進項常規(guī)石蠟切片脫蠟后，放入純水中2 min；③放入微波爐中高火煮沸后，將玻片放入插槽中，改中火7 min進行高溫修復；取出后室溫30 min冷卻后，PBS洗滌5 min×3次；④H2O2(消除內源性過氧化物酶)放在濕盒中15 min過PBS 3 min×3；擦片后加入一抗4℃冰箱過夜；⑤拿出濕盒室溫孵育1 h后，PBS沖洗2 min×3次；⑥加二抗孵育15 min后，PBS沖洗3 min×3次；⑦DAB(純水:試劑A:試劑B：試劑C為20∶1∶1∶1)顯色7 min；⑧用顯微鏡觀察，備一盆水用于終止染色；終止染色后，蘇木素染色3 min后，清水洗2次，鏡下觀察染色情況來定分化時間；鹽酸分化10 s后，流水返藍30 min；⑨梯度酒精脫水，中性樹固封。用Image pro plus6.0軟件測量IOD值。

1.3.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差進行描述，多樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，滿足正態(tài)性和方差齊性時，兩兩比較采用LSD法檢驗；方差不齊時，選用Dunnett’S T3法檢驗，檢驗水準α=0.05。各組數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果

2.1 各組肺順應性和氣道阻力肺順應性比較

哮喘模型組氣道阻力較正常對照組明顯升高(P=0.015<0.05)，針刺干預組氣道阻力較哮喘模型組明顯降低(P=0.000<0.05)。哮喘模型組肺順應性較正常對照組明顯降低(P=0.012<0.05)，針刺干預組肺順應性較哮喘模型組明顯升高(P=0.047<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠氣道阻力與肺順應性測定比較

注:與哮喘模型組比較，#P<0.05；與正常對照組比較，*P<0.05；與針刺干預組比較，▲P>0.05

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

經HE染色觀察顯示，哮喘模型組大鼠肺組織可見肺泡內結構損壞，支氣管黏液水腫，粘液栓形成，管腔變窄，氣道平滑肌肥大增厚，支氣管上皮結構不規(guī)則、細胞脫落；氣道壁及肺間質中大量炎細胞浸潤。針刺干預組較模型組肺組織炎癥減輕，氣管及肺泡形態(tài)結構較完整，管腔內偶見分泌物滯留，炎性細胞少量分布，氣道平滑肌增厚及狹窄顯著好轉，與正常對照組較接近。見圖1。

2.3 各組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES蛋白陽性表達值

哮喘模型組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達水平顯著高于正常對照組(均P<0.05)，針刺干預組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達水平較哮喘模型組明顯降低(均P<0.05)。見表2、圖2和圖3。

表2 各組大鼠肺組織平均IOD值的比較

注:與哮喘模型組比較，#P<0.05；與正常對照組比較，*P<0.05；與針刺干預組比較，▲P>0.05

圖1 各組大鼠肺組織病理變化(HE×200)注:箭頭所指為氣管

圖2 各組大鼠肺組織Eotaxin表達

圖3 各組大鼠肺組織RANTES表達

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學對哮喘發(fā)病機制的分析，大多集中在氣道高反應、氣道炎癥及氣道重塑等方面[10]。而對哮喘大鼠氣道高反應性的評估主要通過觀察大鼠肺組織氣道阻力及肺順應性的變化。氣道阻力主要指氣體通過呼吸道遇到的摩擦阻力，其變化與管腔的半徑4次方成反比，所以在哮喘發(fā)作支氣管收縮時，管腔半徑的小變化，就會導致氣道阻力發(fā)生巨大改變。肺順應性是測定肺的彈力是否正常的一種方法，能夠反映肺的彈性，當氣道任一部位發(fā)生狹窄或阻塞時可使肺順應性明顯降低[11]。在本實驗中，模型組氣道阻力較正常對照組明顯升高(P<0.05)，針刺干預組氣道阻力較哮喘模型組明顯降低(P<0.05)。哮喘模型組肺順應性較正常對照組明顯降低(P<0.05) ，針刺干預組肺順應性較哮喘模型組明顯升高(P<0.05)。說明哮喘發(fā)作可致氣道阻力增加、肺順應性降低，經針刺后可有效改善氣道阻力，增強肺順應性從而抑制哮喘支氣管痙攣收縮,降低興奮傳導。

氣道炎癥作為哮喘重要的發(fā)病機制，與氣道高反應性關系密切，嗜酸性粒細胞(EOS)是支氣管哮喘氣道炎癥的關鍵效應細胞，它在哮喘氣道的聚集是哮喘發(fā)作的一個中心環(huán)節(jié)，大多數(shù)炎性細胞最終通過EOS產生效應[12]，同時其在氣道的浸潤與活化也決定了哮喘的嚴重程度[13]。Eotaxin 是近年來發(fā)現(xiàn)的嗜酸粒細胞趨化因子，由嗜酸性粒細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞產生，在肺臟內主要由支氣管和肺泡上皮產生，其主要化學作用是吸引EOS在肺內的募集，是一種EOS化學激動劑[14]。且Eotaxin 是唯一一個僅與單一受體CCR-3發(fā)生作用而介導EOS從血管遷移至炎癥肺組織中的趨化因子，趨化嗜酸性粒細胞向炎癥部位聚攏，從而引起局部嗜酸性粒細胞炎癥發(fā)生[15-17]。調節(jié)激活正常T細胞表達和分泌細胞因子(RANTES)是第1個被證實的具有趨化EOS功能的CC趨化因子，在哮喘的早期和后期對嗜酸性粒細胞的趨化起到了重要作用。RANTES主要來源于淋巴細胞、上皮細胞和嗜酸性粒細胞。有研究證實RANTES的表達升高與氣道炎癥的嚴重程度關系密切[18]。在氣道炎癥過程中，RANTES在促進EOS從骨髓中釋放的同時，局部RANTES還可招引EOS聚集于支氣管氣道組織中，激活炎癥細胞，使炎癥介質釋放增加，形成EOS為主的效應細胞形成的氣道炎性病變。本實驗結果顯示，HE染色鏡下哮喘模型組大鼠肺組織病理改變及炎癥程度明顯，經“三穴五針法”針刺干預后，上述改變明顯減輕。哮喘模型組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達水平顯著高于正常對照組(P均<0.05)，針刺干預組大鼠肺組織Eotaxin、RANTES的表達水平較哮喘模型組明顯降低(P均<0.05)。以上說明，“三穴五針法”能有效地降低哮喘模型大鼠肺組織中Eotaxin、RANTES的含量，減輕氣道炎癥反應，從而控制哮喘的發(fā)作。