，， ， ，

糖尿病是威脅人們生活的一種代謝性疾病，近年來(lái)隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)生率逐年升高[1]。有研究顯示，目前我國(guó)糖尿病病人高達(dá)1億人，已經(jīng)成為威脅人們健康的一大疾病[2]。糖尿病病人死亡主要是由血糖升高帶來(lái)的器質(zhì)性損害，糖尿病心肌病(DCM)即是其中之一，其主要特征為心臟微循環(huán)改變，同時(shí)伴有心肌細(xì)胞代謝紊亂以及心肌結(jié)構(gòu)的改變，嚴(yán)重者可導(dǎo)致病人左心室肥厚，甚至收縮和舒張功能障礙，最終導(dǎo)致病人死亡[3]。近年來(lái)大量科研工作者著眼于糖尿病心肌病的治療，但對(duì)于其具體的發(fā)病機(jī)制依然沒(méi)有完全闡明，包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血脂和血糖刺激等均有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，而其中心肌細(xì)胞凋亡又是上述多種機(jī)制的共同結(jié)果，而心肌細(xì)胞凋亡可能貫穿心肌病的發(fā)生以及發(fā)展全過(guò)程[4-6]。石斛是我國(guó)古典藥書(shū)中一味名貴藥材，研究顯示，石斛對(duì)腸胃、腎臟以及心臟等均有很好的調(diào)節(jié)作用，金釵石斛多糖是從金釵石斛中提取的多糖類(lèi)物質(zhì)[7]，藥理活性值得關(guān)注。本研究通過(guò)高脂高糖飲食構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，觀察經(jīng)金釵石斛多糖治療后，心肌改變的特點(diǎn)，為石斛多糖的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只雄性清潔級(jí)SD大鼠，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，合格證號(hào)為2014-007，體重為200 g±20 g，在購(gòu)買(mǎi)后飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)間，在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 洛汀新貝那普利片購(gòu)于諾華制藥；金釵石斛多糖購(gòu)于云南泰鑫源鐵皮石斛有限公司；胰島素測(cè)定試劑盒和血糖測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Trizol試劑購(gòu)于北京天根生物有限公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)于Fermentas Company公司；PCR引物購(gòu)于上海英俊生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒，Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad抗體，對(duì)應(yīng)辣根酶標(biāo)記的二抗以及SABC試劑盒抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；GAPDH抗體購(gòu)于美國(guó)Santa公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組、造模和治療 所有大鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常對(duì)照組、2型糖尿病心肌損傷組(模型組)、金釵石斛多糖低劑量治療組(低劑量組)、金釵石斛多糖中劑量治療組(中劑量組)、金釵石斛多糖高劑量治療組(高劑量組)以及陽(yáng)性藥物貝那普利治療組(陽(yáng)性對(duì)照組)，每組均為10只。

2型糖尿病大鼠模型構(gòu)建采用高脂高糖飲食法，其中高脂飼料由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部配制，主要成分為：67%普通飼料、20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇和1%膽酸鈉，10%紅糖水，由大鼠自由飲食，6個(gè)月后檢驗(yàn)是否造模成功，造模成功標(biāo)準(zhǔn)為連續(xù)7 d血糖測(cè)定值≥15.6 mmol/L。

造模成功后，正常對(duì)照組和模型組日常給予生理鹽水1 mL/(kg·d)灌胃，金釵石斛多糖低、中和高劑量治療組分別給予金釵石斛多糖100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d)及400 mg/(kg·d)灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組則給予貝那普利1 mg/(kg·d)灌胃，共灌胃8周。

1.4 標(biāo)本采集 治療結(jié)束后處死大鼠，處死大鼠前用1%水合氯醛10 mL/kg腹腔麻醉，之后測(cè)定大鼠左心室變化特點(diǎn)，測(cè)定后采用腹主靜脈采血法收集血液，血液收集后立即離心，離心采用低溫高速離心機(jī)，離心速度為4 000 r/min，離心時(shí)間為10 min，10 min后收集上清液置于超低溫冰箱中保存以測(cè)定血糖和胰島素含量，采血后處死大鼠，取出心臟，用生理鹽水沖洗后取心尖處部分用4%多聚甲醛固定，以備HE染色，其余置于超低溫冰箱中用于檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)特點(diǎn)。

1.5 指標(biāo)學(xué)檢測(cè)

1.5.1 血糖 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提示，血糖測(cè)定采用氧化還原法，測(cè)定儀器為分光光度計(jì)。

1.5.2 血漿胰島素 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提示，胰島素的測(cè)定方法為酶法(SWT-1)，測(cè)定儀器為酶標(biāo)儀。

1.5.3 Millar導(dǎo)管測(cè)左心功能 左心功能的測(cè)試采用Millar法測(cè)定，測(cè)定時(shí)暴露大鼠左室心尖部位，之后利用電極探頭在心尖處直接行穿刺，測(cè)定時(shí)由專(zhuān)業(yè)醫(yī)師完成，以控制其可以精確插入左心室，之后對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)使用相關(guān)軟件分析心血管相關(guān)參數(shù)：左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)以及左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。測(cè)定后記錄，導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)即可。

1.5.4 心肌組織蘇木素-伊紅(HE)染色 心肌組織病理學(xué)檢測(cè)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行，采用HE染色，簡(jiǎn)單描述為取材、脫水、石蠟包埋、切片、染色以及觀察。

1.5.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad的檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR法)。①利用Trial法磨碎心臟組織以提取總RNA；②對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量和逆轉(zhuǎn)錄；③擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄的DNA，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，反復(fù)循環(huán)次數(shù)為40次，最后72 ℃延伸5 min即完成。在數(shù)據(jù)收集后采用2-ΔΔCT法統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)指標(biāo)變化特點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)為Bcl-2正向：TGAACCGGCATCTGCACAC，反向：CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG，產(chǎn)物長(zhǎng)度：289 bps；Bcl-xl正向：CCCAGAAAGGATACAGCTGG，反向：GCGATCCGACTCACCAATAC，產(chǎn)物長(zhǎng)度：448 bps；Bax正向：AGACACCTGAGCTGACCTTGGAG，反向：GTTGAAGTTGCCATCAGCAAACA，產(chǎn)物長(zhǎng)度：255 bps；Bad正向：ACCACAAGTCCATGCCATCAC，反向：CCCACACCCTTTTTGGGCA，產(chǎn)物長(zhǎng)度：443 bps；GAPDH正向：ACACTGAGCATCTCCCTCAC，反向：GTTGATTGAGCCTGCTTCACC，產(chǎn)物長(zhǎng)度：198 bps。

1.5.6 Western blot測(cè)定 Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad蛋白的檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行，從低溫冰箱中取出心臟組織后稱(chēng)取100 mg后用組織裂解液充分使組織裂解，之后提取上清液，定量調(diào)平后每組各取60 mg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，之后將載有轉(zhuǎn)移蛋白的PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉2 h，2 h后取出，洗滌3次后加入相應(yīng)1抗，4 ℃過(guò)夜后洗膜3次，之后加入對(duì)應(yīng)的二抗孵育2 h，洗滌3次后暗室與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片，掃描，計(jì)算各條帶的灰度值即完成。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 大鼠死亡情況統(tǒng)計(jì)，正常對(duì)照組大鼠無(wú)死亡，模型組2只大鼠死亡，金釵石斛多糖低劑量組1只大鼠死亡，中劑量組和高劑量組無(wú)死亡，陽(yáng)性對(duì)照組1只大鼠死亡。

大鼠活動(dòng)情況統(tǒng)計(jì)，正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，行為敏捷，毛色發(fā)白有光澤；模型組則有明顯的多飲、多食和多尿的特點(diǎn)，較正常對(duì)照組明顯肥胖，毛色發(fā)黃干燥；金釵石斛多糖3個(gè)劑量治療組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠活動(dòng)情況較模型組明顯好轉(zhuǎn)，但和正常對(duì)照組比較差異仍較明顯。

2.2 各組大鼠血糖和胰島素含量比較 模型組與正常對(duì)照組比較，血糖和胰島素抵抗指數(shù)明顯升高(P<0.05)，胰島素含量明顯下降(P<0.05)；金釵石斛多糖低劑量組與模型組比較，血糖和胰島素抵抗指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血糖和胰島素抵抗指數(shù)較模型組明顯降低(P<0.05)。金釵石斛多糖3個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組胰島素含量較模型組明顯升高(P<0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組血糖值明顯低于金釵石斛多糖低劑量組(P<0.05)，金釵石斛多糖中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血糖值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血糖、胰島素含量以及胰島素抵抗指數(shù)比較(±s)

2.3 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 模型組LVSP、±dp/dtmax較正常對(duì)照組明顯降低，而LVEDP則明顯升高。經(jīng)金釵石斛多糖以及貝那普利治療后，較模型組大鼠心肌組織LVSP和±dp/dtmax均明顯升高，而LVEDP則明顯降低。金釵石斛多糖3個(gè)劑量治療組有明顯的劑量依賴(lài)性，且金釵石斛多糖中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組療效基本一致，而金釵石斛多糖高劑量組4個(gè)指標(biāo)改善程度均明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)比較(±s)

2.4 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果 正常組大鼠心肌纖維排列整齊，沒(méi)有斷裂，同時(shí)走形也正常，細(xì)胞核呈圓形和橢圓形；而模型組大鼠則有明顯的排列紊亂，細(xì)胞纖維有明顯的斷裂，細(xì)胞核有不同程度的變性；經(jīng)金釵石斛多糖及貝那普利治療后，其心肌細(xì)胞變性明顯好轉(zhuǎn)。同時(shí)低劑量組、中劑量組和高劑量有明顯的劑量依賴(lài)性，其病理學(xué)隨著給藥劑量的增加而明顯增加，此外，低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組基本一致，而中劑量組和高劑量組明顯優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組。詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心臟組織HE染色(20×20)

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果 模型組較正常對(duì)照組Bcl-2、Bcl-xl明顯降低，Bax、Bad明顯升高；經(jīng)金釵石斛多糖和貝那普利治療后，Bcl-2和Bcl-xl明顯升高，而B(niǎo)ax和Bad表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。金釵石斛多糖3個(gè)劑量組改善其蛋白表達(dá)有明顯的劑量依賴(lài)性。金釵石斛多糖高劑量組Bcl-2和Bcl-xl明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，Bax及Bad則明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，而低劑量、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2。

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；金釵石斛多糖治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05

圖2各組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad的mRNA擴(kuò)增特點(diǎn)

2.6 Western-Blot檢測(cè)結(jié)果 模型組較正常對(duì)照組Bcl-2和Bcl-xl明顯降低，Bax及Bad含量明顯升高。金釵石斛多糖和貝那普利治療后，Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)量明顯升高，而B(niǎo)ax以及Bad表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。金釵石斛多糖3個(gè)劑量組調(diào)節(jié)上述幾個(gè)指標(biāo)有明顯的劑量依賴(lài)性。金釵石斛多糖高劑量組Bcl-2和Bcl-xl表達(dá)明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，而B(niǎo)ax以及Bad表達(dá)則明顯低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，而低劑量、中劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖3。

與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；金釵石斛多糖治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05。

圖3各組大鼠心臟組織中Bcl-2、Bcl-xl、Bax和Bad蛋白的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

糖尿病是威脅我國(guó)以及世界人民健康的第三大疾病，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)文化的發(fā)展，人們的物質(zhì)生活水平逐漸提高，糖尿病的發(fā)生率也明顯升高[10]。糖尿病本身的危害與血糖升高以及胰島素分泌不足密切相關(guān)，而死因主要為其造成的心、肝、脾、腎等臟器損害，特別是對(duì)心血管的損害，一旦發(fā)生，給病人帶來(lái)極大危害[11]。研究發(fā)現(xiàn)，由血糖升高帶來(lái)的胰島素抵抗指數(shù)升高對(duì)心肌細(xì)胞的毒性是直接刺激的[12]，此外，較高的胰島素抵抗也可以誘發(fā)破壞心肌細(xì)胞因子產(chǎn)生，如誘發(fā)血管硬化、代謝紊亂等氧化應(yīng)激，這些病理因子又可反作用于心肌細(xì)胞，最終造成心臟損害[13]。糖尿病左心室重塑是糖尿病心臟損害最為常見(jiàn)的一種類(lèi)型，其病理改變較為復(fù)雜，主要病理學(xué)表現(xiàn)有心肌肥厚和間質(zhì)纖維化，病癥為心力衰竭及心律失常。

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)是藥物可以被用于臨床的關(guān)鍵過(guò)程之一，目前對(duì)于糖尿病心肌損傷的動(dòng)物模型，主要有3種方法[14-16]，分別為：轉(zhuǎn)基因或基因沉默大鼠、短期高脂飲食+鏈脲佐菌素注射以及長(zhǎng)期高脂高糖飲食誘導(dǎo)，其中轉(zhuǎn)基因大鼠由于造價(jià)高，同時(shí)藥物治療死亡率高，而不被廣泛采用，因此，短期高脂飲食+鏈脲佐菌素注射以及長(zhǎng)期高脂高糖飲食誘導(dǎo)是最主要的方法，但在實(shí)際使用時(shí)也有稍許不同，短期高脂飲食+鏈脲佐菌素注射所形成的大鼠模型，造模時(shí)間較短，糖尿病成模率高，但是在造模過(guò)程中也存在死亡率較高的問(wèn)題，此外，由于造模時(shí)間較短的問(wèn)題，心肌損害并不嚴(yán)重，因此其在應(yīng)用于糖尿病心肌病的研究方面有明顯的缺陷，而長(zhǎng)期高脂高糖飲食則不同，雖然造模時(shí)間較長(zhǎng)，造?；ㄙM(fèi)也相對(duì)較高，但是其所構(gòu)建的模型與人體模型特別類(lèi)似，特別是對(duì)臟器的損害屬于一個(gè)緩慢的過(guò)程。因此，本研究采用高脂高糖飲食6個(gè)月構(gòu)建2型糖尿病心肌損害大鼠模型。所有大鼠均造模成功，大鼠具有明顯的心肌受損。

石斛主要化學(xué)成分為多糖、生物堿、酚類(lèi)、氨基酸以及揮發(fā)油等[17]。已有研究證實(shí)，石斛醫(yī)用價(jià)值較高，其可以減慢病人心率，同時(shí)拮抗過(guò)多的腎上腺素，以及腎臟分泌的5-羥色胺等，進(jìn)而起到對(duì)心臟和腎臟的保護(hù)作用，還可以收縮腸系膜血管、降低血黏度、抗自由基損傷等[18-19]。而石斛多糖作為石斛的最主要成分之一，藥學(xué)價(jià)值極高，特別是金釵石斛，主要有七大功效，分別為：①抗腫瘤作用；②具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用；③抗突變作用；④降血壓、血脂和血糖作用；⑤抗病毒的作用；⑥抗氧化作用；⑦保護(hù)腸胃[20-21]。鑒于文獻(xiàn)報(bào)道石斛多糖對(duì)糖尿病具有很好的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)其對(duì)抗凋亡也有較好的作用。本研究采用金釵石斛多糖干預(yù)糖尿病大鼠，以觀察其對(duì)心肌是否有保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示，金釵石斛多糖不僅對(duì)降低血糖具有明顯的促進(jìn)作用，其還可以升高血清胰島素含量，降低胰島素抵抗指數(shù)，對(duì)糖尿病具有很好的輔助治療作用；此外，其對(duì)左心室功能的改善最為明顯，效果明顯高于臨床中目前常用的保護(hù)心肌的藥物貝那普利。

糖尿病引起心肌損害以及左心室重塑的核心為心肌細(xì)胞的凋亡。心肌細(xì)胞凋亡貫穿著整個(gè)糖尿病心肌病的發(fā)展[22]。而細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到多種因子的調(diào)控，而在這些調(diào)控的蛋白中，Bcl-2原癌基因家族蛋白是研究最為廣泛，也是最為重要的一種蛋白，Bcl-2家族蛋白控制細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩條途徑實(shí)現(xiàn)，途徑之一為自身分泌抗凋亡蛋白Bcl-2以及Bcl-xl等，通過(guò)分泌這些蛋白起到抵抗細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用，而另一條途徑為凋亡促進(jìn)，其分泌蛋白主要為Bax和Bad等，兩條途徑互為對(duì)立，通過(guò)自身的動(dòng)態(tài)平衡來(lái)調(diào)節(jié)凋亡的發(fā)生[23-25]。本研究顯示，金釵石斛多糖對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-xl具有明顯的促進(jìn)分泌作用，降低Bax和Bad的表達(dá)，最終有效保護(hù)心肌細(xì)胞，組織病理學(xué)檢測(cè)也證實(shí)其是有效的。

長(zhǎng)期高脂高糖飲食構(gòu)建的2型糖尿病大鼠不僅有血糖升高和胰島素含量降低，此外其心肌細(xì)胞明顯受損，凋亡明顯加速。金釵石斛多糖則可以降低血糖，升高胰島素含量，提高左心室功能，進(jìn)而保護(hù)心肌，分析其機(jī)制，可能是通過(guò)升高Bcl-2和Bcl-xl，降低Bax和Bad表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。