孫麗華，劉麗紅，李萬水，張 歆，楊蓉婭

鮮紅斑痣(port wine stains，PWS)是一種發(fā)生在真皮淺層的先天性毛細血管擴張畸形，發(fā)病率為0.3%～0.5%。出生時皮損呈粉紅色斑片，未經(jīng)治療的皮損，通常隨著年齡的增長，顏色逐漸加深，皮損漸增厚形成斑塊或結節(jié)狀，不僅影響皮膚的正常生理功能，還會對患者心理健康帶來傷害。脈沖染料激光（pulsed dye laser，PDL）治療PWS已30多年，一直被認為是PWS治療的“金標準”。但是，大量的臨床研究表明，僅10%～15%PWS患者經(jīng)過多次PDL治療后皮損能得到徹底地清除，有20%～30%的患者出現(xiàn)對PDL治療抵抗[1]。因此，臨床上需要不斷地發(fā)展新的設備代替或輔助傳統(tǒng)的激光來治療PDL抵抗型或增厚型PWS，以增加皮損的清除率。

點陣微針射頻（fractionated microneedle radiofrequency，F(xiàn)MRF）是利用矩陣式排列的微針，刺破表皮層，可控地到達真皮層或皮下脂肪層，針尖發(fā)射射頻對組織進行加熱，有效避免了表皮的熱損傷。臨床上，F(xiàn)MRF主要應用于面部松弛、皺紋、毛孔粗大、痤瘡萎縮性瘢痕、腋臭及膨脹紋的治療[2-4]。筆者應用FMRF治療面部年輕化和痤瘡凹陷性瘢痕時，發(fā)現(xiàn)患者面部的毛細血管擴張和痤瘡后遺紅斑均得到改善甚至完全消退，說明射頻能量對毛細血管擴張有一定的治療作用，文獻報道也有類似的結果[5]。因此，推測FMRF可能適用于PWS的治療，由于其治療深度在皮下0.5～5 mm可調(diào)，尤其適用于增厚型PWS的治療。本實驗選用雄性萊亨雞雞冠為動物模型，通過觀察FMRF干預雞冠后血管數(shù)量變化及Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例變化情況，為FMRF臨床治療PWS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級雄性萊亨雞30只（北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司）；鹽酸賽拉嗪注射液（吉林省華牧動物保健品有限公司）；Ⅰ型膠原兔抗人多克隆抗體和Ⅲ型膠原兔抗人多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司）；Bodytite射頻治療儀（以色列InvasixLtd公司）裝有一個手柄和一次性治療頭，治療頭參數(shù)：5×5根近端絕緣的32-G微針電極，進針深度是1～3 mm，發(fā)射射頻的針尖長度 是0.6 mm；Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件。

1.2 方法

FMRF治療參數(shù)包括：能量、脈寬、進針深度，F(xiàn)MRF進針深度為1.5 mm，將能量和脈寬分別設定低、中、高3個級別得到治療參數(shù)組合如下：治療組（10 W/1 000 ms/1.5 mm、10 W/1 500 ms/1.5 mm、10 W/2 000 ms/1.5 mm、16 W/1 000 ms/1.5 mm、16 W/1 500 ms/1.5 mm、16 W/2 000 ms/1.5 mm、20 W/1 000 ms/1.5 mm、20 W/1 500 ms/1.5 mm、20 W/2 000 ms/1.5 mm）和空針組（0 W/1 000 ms/1.5 mm、0 W/1 500 ms/1.5 mm、0 W/2 000 ms/1.5 mm），空白組（不做任何處理），每組參數(shù)組合隨機在6只動物雞冠上進行處理。 處理前予鹽酸賽拉嗪注射液，0.1 ml/kg，肌內(nèi)注射對實驗動物進行麻醉。雞冠一側用甲紫筆標記實驗區(qū)域，其對側雞冠不做任何處理，作為自身對照。用0.1%苯扎溴銨溶液消毒，隨后對每個實驗區(qū)域予FMRF處理。干預后實驗動物相同條件下飼養(yǎng)28 d。分別在干預后的第14、28天對實驗動物麻醉后，用微型環(huán)鉆分別鉆取各個實驗區(qū)域全層雞冠組織，實驗側的對側雞冠組織為其自身對照。10%甲醛溶液固定，行組織病理切片行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化染色。

1.2.1 一般情況 觀察并記錄各組雞冠在干預前、干預后即刻、第3天、7天、14天、28天的大體形態(tài)學變化，攝相并存檔。

1.2.2 HE染色 干預后第14天、28天，光學顯微鏡下觀察，并拍照保存記錄。每張切片隨機選擇5個高倍視野進行血管計數(shù)（10×40），計算出毛細血管平均數(shù)，毛細血管減少率=（自身對照側毛細血管平均數(shù)－實驗側毛細血管平均數(shù)）/自身對照側毛細血管平均數(shù)×100%，計算出各組雞冠的毛細血管減少率。

1.2.3 免疫組化染色 取雞冠組織蠟塊切片，分別行Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維免疫組化染色。采用Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，每個標本隨機選取5個視野，軟件分析陽性染色面積和總面積，分別計算出陽性百分比，即Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原所占的面積百分比。Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例=Ⅰ型膠原面積百分比/Ⅲ型膠原面積百分比。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件包進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗，干預后14 d和28 d時間上的差異采用重復測量的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

觀察期內(nèi)實驗動物一般情況良好，無動物死亡。FMRF干預后即刻，治療組及空針組實驗區(qū)域均出現(xiàn)紅斑、水腫及點狀滲血。干預后第3天，治療組紅斑、水腫減輕，出現(xiàn)點狀結痂（圖1a）；空針組紅斑、水腫完全消退（圖1b）。干預后第7天，治療組紅斑、水腫基本消退，實驗區(qū)顏色輕度發(fā)白，矩陣式排列的點狀結痂明顯（圖1c）；空針組實驗區(qū)域恢復正常鮮紅色（圖1d）。干預后第14天，治療組恢復正常鮮紅色，痂皮逐漸脫落；空針組痂皮完全脫落，創(chuàng)面愈合。干預后第28天，治療組和空針組實驗區(qū)域雞冠均恢復正常顏色 。各組雞冠均未出現(xiàn)萎縮及瘢痕形成。

2.2 HE染色觀察

干預后第14天，治療組實驗側雞冠組織真皮乳頭層毛細血管數(shù)量減少、血管管徑變小，管腔內(nèi)紅細胞減少，少量膠原纖維增生。干預后第28天，治療組實驗側雞冠真皮乳頭層毛細血管數(shù)量明顯減少、血管管徑變小，部分血管閉鎖，膠原纖維增生明顯?？蔗樈M及各組自身對照組織病理比較無明顯變化，表皮大致正常，真皮乳頭層可見大量擴張的毛細血管、管腔較大（圖2）。

圖1 FMRF干預后3 d、7 d雞冠大體形態(tài)觀察

圖2 FMRF干預后28 d雞冠組織病理（HE×400）

2.3 毛細血管減少率

FMRF干預后第14天，所有治療組雞冠毛細血管減少率與空針組雞冠毛細血管減少率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。治療組之間兩兩比較，10 W/1 000 ms/1.5 mm與16 W/2 000 ms/1.5 mm有顯著差異（P=0.024）；10 W/1 000 ms/1.5 mm與20 W/1 500 ms/1.5 mm有顯著差異（P=0.008）；10 W/1 000 ms/1.5 mm與20 W/2 000 ms/1.5 mm有顯著差異（P＜0.001）；10 W/1 500 ms/1.5 mm與20 W/2 000 ms/1.5 mm有顯著差異（P=0.007）；16 W/1 000 ms/1.5 mm與20 W/2 000 ms/1.5 mm有顯著差異（P=0.002）；其他治療組之間及空針組之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 FMRF干預后第28天，各組毛細血管減少率見表1。采用重復測量的方差分析對FMRF干預后14 d及28 d的血管減少率結果進行檢驗，不同時間測量的血管減少率有統(tǒng)計學差異，F(xiàn)=11.767，P=0.001，即FMRF干預雞冠后28 d血管減少率較14 d時的血管減少率差異有統(tǒng)計學意義，血管的數(shù)量進一步的減少。

2.4 免疫組化染色

FMRF干預雞冠后28 d，各組雞冠Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例通過單因素方差分析比較有顯著性差異，P＜0.001。通過兩兩比較，空白組、空針組、10 W/1 000 ms/1.5 mm、10 W/1 500 ms/1.5 mm、10 W/2 000 ms/1.5 mm、16 W/1 000 ms/1.5 mm、16 W/1 500 ms/1.5 mm之間無顯著性差異；但與16 W/2 000 ms/1.5 mm、20 W/1 000 ms/1.5 mm、20 W/1 500 ms/1.5 mm、20 W/2 000 ms/1.5 mm 4組比較差異均有統(tǒng)計學意義 ，P＜0.001（表2）。

表1 FMRF干預后14 d、28 d各組毛細血管減少率（±s，%）

表1 FMRF干預后14 d、28 d各組毛細血管減少率（±s，%）

組 別 14 d 28 d 0 W/1 000 ms/1.5 mm 0.83±2.99 2.50±1.05 0 W/1 500 ms/1.5 mm -2.83±1.17 0.67±3.88 0 W/2 000 ms/1.5 mm -2.00±6.07 -1.17±3.71 10 W/1 000 ms/1.5 mm 52.33±5.82 52.83±6.88 10 W/1 500 ms/1.5 mm 57.33±7.26 58.83±6.56 10 W/2 000 ms/1.5 mm 62.67±6.15 61.50±4.04 16 W/1 000 ms/1.5 mm 56.00±8.58 60.33±9.87 16 W/1 500 ms/1.5 mm 62.50±6.03 65.83±10.05 16 W/2 000 ms/1.5 mm 66.17±6.91 69.00±8.30 20 W/1 000 ms/1.5 mm 60.50±6.16 65.17±5.74 20 W/1 500 ms/1.5 mm 67.33±5.96 68.50±3.51 20 W/2 000 ms/1.5 mm 72.50±8.87 75.67±6.98

表2 FMRF干預后28 d各組Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維比值（±s）

表2 FMRF干預后28 d各組Ⅰ/Ⅲ型膠原纖維比值（±s）

組 別 28 d空白組 0.93±0.01 0 W/1 000 ms/1.5 mm 0.90±0.02 0 W/1 500 ms/1.5 mm 0.91±0.02 0 W/2 000 ms/1.5 mm 0.94±0.03 10 W/1 000 ms/1.5 mm 0.91±0.03 10 W/1 500 ms/1.5 mm 0.93±0.03 10 W/2 000 ms/1.5 mm 0.94±0.04 16 W/1 000 ms/1.5 mm 0.93±0.02 16 W/1 500 ms/1.5 mm 0.96±0.02 16 W/2 000 ms/1.5 mm 1.05±0.03 20 W/1 000 ms/1.5 mm 1.04±0.03 20 W/1 500 ms/1.5 mm 1.14±0.05 20 W/2 000 ms/1.5 mm 1.12±0.04

3 討論

FMRF是近幾年新興的一種治療方法，通過微針電極將射頻能量直接傳遞到目標組織部位，能量大小、作用時間和進針深度均可控制，相對于傳統(tǒng)的點陣激光，不僅保護了表皮不受損傷，還避免靶色基位置和能量被吸收的不確定性[6]。Min等[5]應用FMRF治療痤瘡后紅斑，皮損組織病理檢查發(fā)現(xiàn)血管減少，免疫組化染色可見皮膚組織中VEGF染色強度減弱，故推斷FMRF具有抗不正常的血管增生作用。

本實驗采用FMRF干預雞冠后第14天和28天對雞冠行組織病理學檢查，見治療組真皮乳頭層毛細血管數(shù)量明顯減少，血管管徑變小，部分血管管腔閉鎖，而空針組及對側未處理的自身對照組雞冠血管數(shù)量未見減少，血管管腔擴張明顯。通過Bonferroni檢驗兩兩比較，所有治療組雞冠的毛細血管減少率與空針組的毛細血管減少率比較差異均有統(tǒng)計學意義。說明FMRF干預PWS動物模型雄性萊亨雞雞冠后，可有效減少雞冠真皮層毛細血管的數(shù)量。治療組之間兩兩比較，并不是所有低、中、高能量/脈寬之間差異均有統(tǒng)計學意義，低能量/低脈寬組與高能量/高脈寬組的毛細血管減少率差異有統(tǒng)計學意義。各治療組的毛細血管減少率是隨著能量和脈寬的增加，呈增加的趨勢，提示FMRF對雞冠組織血管的損傷強度隨著射頻能量和脈寬的增大而增強，這對今后臨床應用FMRF治療血管性疾病治療參數(shù)的選擇具有一定的指導意義。

膠原是細胞外基質的最主要的成分，在創(chuàng)傷的修復及維持皮膚的張力和彈性中起到至關重要的作用。在創(chuàng)傷愈合早期，膠原纖維排列疏松，主要以Ⅲ型膠原為代表，它的特點是維持組織的柔韌度，即決定了組織修復后的彈性。在創(chuàng)傷愈合的后期，Ⅲ型膠原逐漸被吸收，Ⅰ型膠原分泌增加，它有利于創(chuàng)面的收縮緊致并增強組織的表面張力，從而增加傷口的抗拉伸強度[7]。組織在創(chuàng)傷修復的早、中、晚期，Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原處于一個動態(tài)變化的過程，但正常的損傷修復，恢復后期都會產(chǎn)生一個相對穩(wěn)定的Ⅰ型/Ⅲ型膠原比值。因此，本實驗觀察了修復后期，即FMRF干預后第28天，雞冠組織的Ⅰ型/Ⅲ型膠原的比值，結果提示，在一定的射頻能量和脈寬范圍內(nèi)，雞冠修復后均能保持穩(wěn)定的Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例，與空白組及空針組比較無顯著性差異。但是，當FMRF的能量/脈寬＞16 W/2 000 ms時，Ⅰ型/Ⅲ型膠原比例開始出現(xiàn)增高，提示治療能量過大可能會造成雞冠組織出現(xiàn)纖維化的風險。

既往已有應用射頻（radiofrequency，RF）治療血管性疾病的報道[8,9]。RF可以使小的血管完全封閉，對于管徑較粗的血管也可實現(xiàn)血管直徑縮小，部分血流限制，是一種非常有應用前景的血管封閉治療手段。本實驗通過觀察FMRF干預動物模型雞冠，得出RF可以有效地減少雞冠毛細血管數(shù)量，雞冠組織大體觀察未見萎縮及瘢痕形成，證實了FMRF應用于治療PWS患者的有效性和安全性。相對傳統(tǒng)激光治療PWS，F(xiàn)MRF治療的優(yōu)勢有以下3點：①靶色基，RF熱作用產(chǎn)生主要取決于組織的阻抗，即RF波作用于組織的水分子，使雙極水分子發(fā)生振動，通過高速旋轉摩擦產(chǎn)生熱量；而激光是通過選擇性光熱作用原理產(chǎn)生熱量，對于深膚色人群，激光治療發(fā)生不良反應的風險增加。②表皮的保護，F(xiàn)MRF是通過矩陣式排列的微針將RF能量直接輸送到需要治療的靶組織位置，而接觸表皮處的針體不發(fā)射RF，不會對表皮造成熱損傷；而激光需透過表皮才能到達目標部位，因此，多需要另配冷卻裝置來避免表皮的熱損傷。③治療的深度，F(xiàn)MRF作用深度可以根據(jù)皮損的深度、厚度進行調(diào)控；而激光作用深度與其波長相關，理論上波長越長，穿透越深。由于激光的穿透性和吸收特性，往往決定了穿透深度和血紅蛋白對其選擇性吸收的強度不能同時兼顧。因此，F(xiàn)MRF可作為PWS的聯(lián)合治療手段，給臨床上PDL抵抗型或增厚型PWS患者帶來新的希望。